73株海鲈源嗜水气单胞菌的耐药性分析

陈雪影 叶彩燕 柴文君 黄锦炉 曾林

摘 要：2015—2019年，从不同地区发病海鲈体内分离得到73株嗜水气单胞菌，对其进行了9种抗菌药物的抗药性比较研究，均以M-H培养基进行药物敏感试验，并根据杭州天和微生物试剂有限公司提供的判定标准评估敏感性。结果表明，分离菌株对复方新诺明耐药率为77%（56/73），对四环素类的多西环素和四环素的耐药率分别为42%（31/73）、34%（25/73），对氨基糖苷类的新霉素、庆大霉素、卡那霉素敏感率为86%（63/73）、78%（57/73）、68%（50/73），对恩诺沙星和氟苯尼考敏感率为70%（51/73）、71%（52/73）。

关键词：海鲈;嗜水气单胞菌;耐药性分析

中图分类号 S941  文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）17-0110-03

The Resistance to Antibiotics of Aeromonas hydrophila Isolated from Lateolabrax japonicas

CHEN Xueying1，2 et al.

（1Guangdong Haid Group Co.， Ltd， Guangzhou 510000， China; 2 Zhuhai Hailong Biotechnology Co.， Ltd， Zhuhai 519000， China）

Abstract：To investigate the resistance of 73 Aeromonas hydrophila strains isolated from Lateolabrax japonicas in different areas in 2015—2019， and provide reasonable basis for controlling disease caused by Aeromonas hydrophila. The isolations to nine antibiotics was analyzed by M-H medium and the sensitivity was evaluated according to the criteria provided by Hangzhou microorganism. Asthe results showed， 77% （56/73） ，42% （31/73） and 34% （25/73）isolations were resistant to sulfamethoxzzole，tetracycline and doxycycline， respectively. The sensitivity rates of neomycin， gentamycin，kanamycin，enrofloxacin and florfenicol were 86% （63/73）， 78% （57/73）， 68% （50/73）， 70% （51/73） and71% （52/73）.

Key words： Lateolabrax japonicas; Aeromonas hydrophila; Antibiotics; Resistance

海鱸（Lateolabrax japonicus），又称花鲈或七星鲈，隶属于鲈形目、鳍鲈科、花鲈属，是我国沿海区域重要的养殖品种之一。广东珠海是海鲈养殖重点区域，年产量约12万t，占全国总产量的近70%，现珠海斗门海鲈均采用传统的池塘高密养殖模式[1]。近年来，随着海鲈养殖技术的不断成熟，养殖密度大断加大，养殖环境也不断恶化，导致病害问题日趋严峻。一方面，细菌性疾病如诺卡氏菌和病毒病如虹彩病毒等，发病率高、传染性性强、死亡量大、治疗十分困难，给养殖业造成了巨大损失;另一方面，一些条件致病菌如嗜水气单胞菌，由于其发病症状不如诺卡氏菌好辨认，一线从业人员对其认识不足和缺乏相关实验室诊断工具，存在对该菌重视度不足的现象，仍凭以往的养殖经验使用调水、换水，没有及时对症下药，以至于损失扩大[2-3]。

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）属弧菌科、气单胞菌属，可引起多种水生动物患肠炎或败血症，如罗非鱼的腐皮病、草鱼的肠炎病、牛蛙的红腿病、鳖的穿孔病、鲟鱼的败血症等[4-7]。当前，国内关于海鲈嗜水气单胞菌的研究报道甚少，一方面可能由于养殖区域较窄，未引起广大研究者的关注;另一方面，海鲈疾病的研究多数集中在诺卡氏菌等专一性疾病，嗜水气单胞菌病尚未引起重视。而嗜水气单胞菌属条件致病菌，在不适其生长繁殖的条件下，若水温较低、水质良好，一般不会致病。但如果放养密度大、水温升高、水质恶化、鱼体机械损伤、鱼体质下降等因素，可能会造成鱼体感染发病。为此，本试验以分离自不同年份和区域的海鲈源嗜水气单胞菌73株为研究对象，采用琼脂扩散法比较不同嗜水气单胞菌分离株的药物敏感性，以期为海鲈嗜水气单胞菌的防治提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验菌株 嗜水气单胞菌73株，分离自不同区域海鲈，由广东海大集团海大研究院保存提供。菌株来源如表1所示。

1.2 细菌的培养 按无菌操作要求，挑取低温保存的嗜水气单胞菌活化后接种于LB营养肉汤培养基，30℃，120 r/min 恒温振荡培养24h，收集菌液，4000r/min离心5min收集菌体，用生理盐水进行稀释，将稀释菌液与 McFarland比浊管进行细菌计数，使受试菌株的菌液终浓度均达到3×107 cfu/mL。

1.3 药敏试验 供试抗生素类药敏纸片共9种，恩诺沙星（5μg/片）、氟苯尼考（75μg/片）、新霉素（30μg/片）、庆大霉素（10μg/片）、卡那霉素（5μg/片）、复方新诺明（11.25μg/片）、多粘菌素B（10μg/片）、多西环素（300 IU/片）、四环素（30μg/片），购自杭州天和微生物试剂有限公司。试验方法参考马绪荣等[8]主编的《药品微生物检验手册》推荐的纸片琼脂扩散法。用无菌棉签取生理盐水稀释的菌液，在M-H琼脂培养基表面均匀涂布，将培养基30℃恒温箱中静置数分钟，使琼脂培养基表面干燥，用无菌镊子将不同的药敏纸片均匀地贴在琼脂培养基的表面，30℃，培养24h。观察、测量各菌株的抑菌圈直径。结果判定参照杭州天和微生物试剂有限公司提供的判定标准进行。

2 结果与分析

2.1 耐药率 检测结果显示，供试菌株对复方新诺明、多西环素、四环素、多粘菌素B、氟苯尼考的耐药率较高，分别为77%、42%、34%、26%、23%。对恩诺沙星和庆大霉素的耐药率分别为4%、1%。对新霉素和庆大霉素的耐药率为0。供试菌株对新霉素、庆大霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、卡那霉素、多粘菌素的敏感率分别为86%、78%、71%、70%、68%、52%。对多西环素、四环素、新霉素3种药物的敏感率为0（见表2）

2.2 不同年份嗜水气单胞菌药敏试验结果 由表3可知，2015—2019年间，嗜水气单胞菌对恩诺沙星和庆大霉素的耐药率有升高的趋势，恩诺沙星由0升高为15%，庆大霉素由0升高为8%，说明嗜水气单胞菌对2种药物出现了耐药。2015—2019年间，嗜水气单胞菌对新霉素和卡那霉素的耐药率保持为0，未出现耐药菌株。嗜水气单胞菌对氟苯尼考、多西环素、多粘菌素B、复方新诺明的耐药性呈先升高后下降的趋势，但与年份无明显规律。2015—2019年间，嗜水气单胞菌对恩诺沙星和庆大霉素的敏感率有下降的趋势。对多西环素、四环素、复方新诺明的敏感率一直为0，说明嗜水气单胞菌对3种药物不敏感。嗜水气单胞菌对氟苯尼考、新霉素、卡那霉素、多粘菌素B的敏感性与时间无明显规律。综合来看，分离株对氨基糖苷类、喹诺酮类、酰胺醇类、多肽类药物敏感，对复方新诺明、四环素类不敏感。

3 讨论

嗜水气单胞菌广泛分布于自然界中，通常在水体养殖环境恶化和鱼体体质较弱时，对多种养殖鱼类具有不同程度的致病性，若防控不及时或用药不当时，可造成养殖鱼类的大面积死亡[9]。因此，针对不同分离源嗜水气单胞菌开展菌株耐药性分析，对于有效防控该菌感染病例具有十分重要的指导意义。

根据药敏试验结果，73株海鲈源嗜水气单胞菌对氨基糖苷类、喹诺酮类、酰胺醇类的敏感性较高，新霉素、庆大霉素、卡那霉素达86%（63/73）、78%（57/73）、68%（50/73），恩诺沙星和氟苯尼考达70%（51/73）、71%（52/73）的敏感率，与其他研究结果相似[10-11]。分离株对四环素类药物耐药，如多西环素和四环素的耐药率分别为42%（31/73）、34%（25/73）。此外，77%（56/73）的菌株对复方新诺明耐药，与金珊等[12]报道的复方新诺明具有抑菌作用的结果有一定的差异。但供试嗜水气单胞菌普遍对恩诺沙星、氟苯尼考、庆大霉素、新霉素等抗生素在内的药物敏感。通过对药敏结果的回顾分析发现，不同年份分离的嗜水气单胞菌对同一种抗生素的耐药程度是存在差异，如2015—2019年间，嗜水气单胞菌对恩诺沙星和庆大霉素的耐药率随时间的推移呈升高的趋势，恩诺沙星的耐药率由0升高为15%，对庆大霉素耐药率由0升高为8%，说明嗜水气单胞菌对2种药物出现了耐药。但嗜水气单胞菌对氟苯尼考、多西环素、多粘菌素B、复方新诺明的耐药性呈先升高后下降的趋势，与年份无明显规律。有学者认为，以上现象与养殖地区长期使用单一药物、给药途径、用药剂量以及耐药菌株通过各种媒介传播等因素密切相关[13-14]。

在监测过程中，采样的鱼池均没有暴发嗜水气单胞菌病，但细菌分离鉴定却检测到鱼体中存在较高的嗜水气单胞菌感染率，因此嗜水气单胞菌作为一种条件致病菌，可以在海鲈体内无症状携带。由于抗生素的使用，可能会抑制嗜水气单胞菌的临床症状，发展出病原菌携带鱼，当养殖密度过大、水质恶化或水温变化时，嗜水气单胞菌病便可能会暴发[15]。该病发生后养殖户常采用控料、停料的方式，但嗜水气单胞菌具有傳染性，未得到较好的控制，合法使用的抗生素具有的一定的效果，在实际中有效剂量却高于普通鱼，内服药物达不到治疗效果，高剂量使用后，往往在上市之前不能达到休药期，从而加大了食品安全隐患。对于防控该病，建议从传染病的角度，如消灭传染源、切断传播途径、降低动物的易感性等措施进行防控，减少抗生素的使用，以确保水产品的质量安全。

参考文献

[1]唐绍林，周国清.池塘养殖海鲈的主要疾病及防治[J].海洋与渔业，2015（3）：46-47.

[2]张俊，周素明，李安兴.广东省养殖罗非鱼、海鲈、尖吻鲈海豚链球菌感染调查[J].中国水产科学，2012，46（1）：161-166.

[3]韦成昱，刘西磊，李义辉，等.海鲈养殖的主要疾病与防治技术[J].安徽农业科学，2015，502（33）：94-95.

[4]王肇赣，徐伯亥.尼罗罗非鱼腐皮病致病菌的研究[J].水产学报，1985，9（3）：217-221.

[5]徐伯亥，熊木林，韩先朴，等.二龄草鱼肠炎病的研究[J].水生生物学报，1987，11（01）：75-84.

[6]肖克宇，陈昌福.水产微生物学[M].北京：中国农业出版社，2004：278-279.

[7]赵凤岐，曹谨玲，刘青.西伯利亚鲟鱼败血症病理学观察与病原学研究[J].水生生物学报，2009，33（2）：316-323.

[8]马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册[M].北京：科学出版社，2000.

[9]汤伏生，朱晓燕.鱼类细菌群落中的致病嗜水气单胞菌[J].水产学报，1995，19（4）：369-373.

[10]陈婷婷.团头鲂源嗜水气单胞菌流行病调查及致病性、耐药性研究[D].武汉：华中农业大学，2014.

[11]朱芝秀，曾志明，何后军.江西地区嗜水气单胞菌流行株的生物学特性[J].江西农业大学学报，2003，025（004）：623-627.

[12]金珊，王国良，赵青松，等.鲈细菌性类结节病的病原及血液病理研究[J].水产学报，2004，28（6）：703-708.

[13]乔毅，万夕和，沈辉.我国水产用抗菌药物耐药性研究进展[J].中国抗生素杂志，2015，05：73-79.

[14]林璐明，苏跃朋.水产抗生素类药物的耐药性机制及合理应用[J].河北渔业，2009（5）：42-43

[15]谢一荣，吴锐全，谢骏，等.维生素C水平对大口黑鲈抵抗嗜水气单胞菌感染的影响.水利渔业，2007，27（5）：102-104.

（责编：张宏民）