长链非编码RNA通过上皮-间质转化对射频消融术后肝癌复发的影响

廖云忠，彭小萍，方恒，江广斌

肝癌发病率在全球范围内位居第6位，死亡率位居第3位[1]；在我国年龄<60岁的男性癌症患者中肝癌发病率位居首位[2]。因肝癌发病过程中症状不明显，以至于很多患者会错过最佳的治疗时间[3]。射频消融术现已逐渐在临床上得到应用，为改善该类患者预后带来新的希望。但据统计，接受射频消融术的肝癌患者的术后复发率很高[4]。这可能与不完全射频消融的残余病灶中肝癌细胞产生的上皮-间质有关[5]。在肝癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的过程中长链非编码RNA(LncRNA)可能具有重要作用[6]，同时他还可以在转录过程、转录后、表观遗传学等多层面来进行基因表达水平的控制[7]。但LncRNA对于射频消融不完全的肝癌细胞的影响未见相关报道。本研究采用模拟状态下研究Huh-7h细胞上皮-间质的生物及转化等特质，并使用LncPathTM芯片筛选Huh-7与Huh-7h细胞差异表达的EMT相关LncRNA，为深入探讨LncRNA调控不完全射频消融肝癌细胞的侵袭分子机制、癌细胞迁移提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 收集湖北医药学院附属随州医院暨随州市中心医院2019年1月至11月20例肝癌患者的癌旁正常组织标本、手术切除肝癌组织标本以及20例肝癌患者射频消融术后穿刺活检的残余肝癌组织标本。Huh-7人肝癌细胞由上海联迈生物工程有限公司提供；胎牛血清、CCK-8、DMEM培养基试剂盒由美国GIBCO公司提供；Transwell小室、基底胶购于北京优尼康生物科技有限公司；波形及E-钙黏蛋白购于德国Chromo Tek公司；基因芯片检测和分析由天津生物芯片技术有限责任公司完成。本研究经过本院伦理委员会的审核，并得到批准，家属或患者签署了知情同意书。

1.2 不完全射频消融肝细胞模型Huh-7h建立 参考Yoshida等[8]报道的方法，采用47 ℃水浴热诱导Huh-7细胞，得到体外模拟不完全射频消融肝癌细胞。具体方法：Huh-7细胞常规培养至覆盖培养皿80%～90%后，47 ℃水浴5 min，继续培养至细胞覆盖培养皿80%，再次47 ℃水浴5 min，按上述程序依次水浴15 min、20 min、25 min；收集存活的细胞为Huh-7h。

1.3 Western blot检测EMT分子标记 将RIPA蛋白提取剂添加到Huh-7细胞、Huh-7h细胞中，采用12 000 r/min离心10 min，取上清，采用BCA法对蛋白进行定量，对各点样孔加入相同质量的蛋白样品，使用SDS-PAGE凝胶电泳，转移至PVDF，封闭1 h，温度保持4 ℃，将兔抗人β-actin多克隆抗体(1∶500)、兔抗人波形蛋白单克隆抗体(1∶200)、鼠抗人E钙黏蛋白单克隆抗体(1∶500)添加其中,静置12 h，而后滴加兔抗人IgG(1∶1 000)或鼠抗人IgG，孵育1 h，当ECL暗室显影、显色时研究条带的灰度值。

1.4 细胞迁移和侵袭能力检测 Transwell细胞侵袭：采用不含有DMEM的培养基，按照15∶1比例融合，抽选100 μl加入上室，成胶后用磷酸缓冲洗，而后加入1×105个细胞，加入5% CO2，温度保持37 ℃，孵育48 h；4%多聚甲醛将其固定30 min，而再用磷酸缓冲洗，在光学显微镜下选取视野，计算细胞平均值。Transwell细胞迁移：Huh-7、Huh-7h细胞计数后，上室加入1×105个细胞，下室加入10%胎牛血清DMEM的培养基，800 μl，剩余步骤同侵袭实验。

1.5 细胞增殖能力检测 准备Huh-7h、Huh-7细胞悬液，密度为1×105/ml；加入96孔板，100 μl/孔，在37 ℃培养箱中加入5%CO2，孵育24 h、48 h、72 h；丢掉细胞培养液，加入100 μl/孔，CCK-8检测液，37 ℃培养箱中加入5%CO2，孵育4 h，使用酶标仪检测吸光值。设5个平行对照。

1.6 LncRNA差异表达分析 Trizol法提取Huh-7和Huh-7h细胞总RNA，使用德国晶芯cRNA扩增标记试剂盒对总RNA进行荧光标记，严格按照说明书进行操作。使用人类LncPathTM芯片技术对荧光标记的cRNA进行杂交；使用Agilent 2100生物芯片分析系统和扫描仪处理。差异基因筛选标准：表达改变≥1.5倍，P<0.05。

2 结果

2.1 细胞EMT分子标记物表达水平比较 Huh-7h细胞上皮表型标志物E-钙黏蛋白相对表达量(2.37±0.35)低于Huh-7细胞相对表达量(5.04±0.82)，差异有统计学意义(t=6.696，P<0.001)；Huh-7h细胞间质表型标志物N-钙黏蛋白相对表达量(6.92±0.68)高于Huh-7细胞相对表达量(3.11±0.47)，差异有统计学意义(t=10.306，P<0.001)；波形蛋白相对表达量(5.70±0.35)高于Huh-7细胞相对表达量(2.04±0.21)，差异有统计学意义(t=20.051，P<0.001)，见图1。

注：1、2为Huh-7细胞；3、4为Huh-7h细胞图1 Western blot检测细胞EMT分子标记物表达水平

2.2 细胞迁移和侵袭能力比较 Transwell细胞迁移实验中，Huh-7h穿膜细胞数(341.50±42.90)高于Huh-7穿膜细胞数(189.00±30.35)，差异有统计学意义(t=6.489，P<0.001)；细胞侵袭实验中，Huh-7h穿膜细胞数(283.73±50.90)高于Huh-7穿膜细胞数(102.68±35.22)，差异有统计学意义(t=6.541，P<0.001)，见图2。

2A:Huh-7细胞侵袭能力检测；2B:Huh-7h细胞侵袭能力检测；2C:Huh-7细胞迁移能力检测；2D:Huh-7h细胞迁移能力检测图2 Transwell检测Huh-7和Huh-7h细胞迁移和侵袭能力(结晶紫染色 ×400)

2.3 细胞增殖能力比较 CCK-8细胞增殖能力检测显示，培养24 h、48 h、72 h时Huh-7h细胞吸光度值高于Huh-7细胞，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 sHuh-7h、Huh-7细胞培养不同时间后的吸光度值比较

2.4 细胞差异表达LncRNA分析 采用LncPathTM芯片收集Huh-7h、Huh-7基因表达数据，聚类分析LncRNA。发现Rpl27p7(ENST00000552432)与Fundc2p4(ENST00000552318)是与差异表达有所关联的下调LncRNA，Mtnd4lp14(ENST00000538558)是与差异表达有所关联的上调LncRNA。经RT-PCR验证，Huh-7h细胞中Fundc2p4相对表达量低于Huh-7细胞，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 RT-PCR检测Huh-7h、Huh-7细胞中差异表达基因相对表达量

2.5 射频消融术后残余肝癌组织中Fundc2p4表达分析 RT-PCR检测结果显示，LncRNA Fundc2p4在癌旁组织中相对表达量(3.48±0.51)高于手术切除的肝癌组织中相对表达量(1.15±0.42)，差异有统计学意义(t=15.772，P<0.001)；LncRNA Fundc2p4在手术切除的肝癌组织中相对表达量(1.54±0.26)高于射频消融术后残余肝癌组织相对表达量(0.21±0.06)，差异有统计学意义(t=22.291，P<0.001)。

3 讨论

射频消融术是目前无法行根治术的中晚期肝癌患者可选择的治疗方案之一，属于局部治疗，但从临床治疗效果来看，因受肝癌病灶解剖位置(如与神经、器官、血管等相邻)、热沉降效应、叠加消融时低温区等影响，癌灶完全消融率偏低[9]。射频消融时若刺激到未完全消融的残余癌组织，可能促进肿瘤的侵袭和转移[10]。通过热诱导肝癌细胞在体外模拟不完全射频消融，结果显示，不完全射频消融可诱发肝癌细胞的EMT形态学改变，侵袭、迁移能力明显增强，钙黏蛋白、波形蛋白、细胞角蛋白等上皮表型标志物表达水平升高[11]。

近年研究发现，肝癌细胞EMT过程中，LncRNA具有重要作用[12]。LncRNA通过靶向作用于ZEB1来调控EMT，导致肝癌预后不良[13]。lncRNA Aoc4p作为肝癌细胞的抑制基因，可以通过与波形蛋白结合，加速溶解，使肝癌细胞的迁移、侵袭能力下降，同时还可抑制EMT[14]。PI3K/Akt信号通路可由白细胞介素6激活，活化Lnc TCF7启动子，从而介导EMT，促进肝癌细胞侵袭[15]。上述研究均表明LncRNA异常表达与肝癌细胞EMT和迁移、侵袭明显相关。本研究通过热诱导Huh-7人肝癌细胞，建立体外不完全射频消融模型Huh-7h细胞；对EMT分子标记物检测显示，Huh-7h细胞的波形蛋白、N-钙黏蛋白相对表达量升高，E-钙黏蛋白相对表达量下降，这表明，在Huh-7h细胞当中确实存在EMT。Transwell细胞迁移和侵袭实验显示，Huh-7h穿膜细胞数高于Huh-7，提示不完全射频消融肝癌细胞的迁移和侵袭能力较原生的肝癌细胞增强，不完全射频消融的肝癌患者转移复发风险可能更高。

在CCK-8与Transwell结果中得出，与LncRNA常规芯片检测LncRNA表达水平相比，LncPathTM芯片检测目的性更强，筛选出差异表达的LncRNA能力更强[16]。采用RT-PCR对筛选出的3个差异表达基因进行检测，得到LncRNA Fundc2p4进行进一步研究发现，在癌旁正常组织、手术切除肝癌组织与射频消融术后残余肝癌组织相比，后者的LncRNA Fundc2p4表达水平最低，提示射频消融不完全的肝癌细胞通过低表达EMT相关的LncRNA Fundc2p4基因来促进EMT，增强癌细胞的迁移和侵袭能力；LncRNA Fundc2p4可能作为抑癌基因参与EMT的调控。

综上，射频消融不完全的肝癌细胞通过低表达EMT相关的LncRNA Fundc2p4基因来促进EMT，增强癌细胞的迁移和侵袭能力，增加肝癌复发的风险。靶向控制以上通路，有可能降低射频消融术后肝癌复发风险，进而改善肝癌患者的预后。