基于H-NMR技术的甲状腺乳头状癌血清代谢组学研究

徐海娥, 李潘, 张慧, 刘建辉, 袁冰, 侯大卫

甲状腺乳头状癌(thyroid papillary carcinoma, PTC)是甲状腺癌中最常见的病理分型,其中肿瘤最大直径<1 cm的乳头状癌被特指为甲状腺微小乳头状癌(thyroid papillary microcarcinoma, PTMC)。甲状腺癌发病率上升的速度明显高于其他肿瘤,自2000年至2011年其发病率增加了近20倍,新增病例的绝大多数为PTMC,占甲状腺癌总体发病率的50%以上[1]。PTMC总体预后较好,然而研究同样发现,部分PTMC的复发率及肿瘤相关死亡率在增加[2-3]。如果在晚期确诊,其5年生存率<60%,复发率高达30%[4]。即使在相同的病理组,甲状腺癌显示出不同的临床行为,在某些情况下,分化良好的癌症比预期的更具侵略性,使之难以预测肿瘤的临床行为[5]。因此,PTC在高危人群中的早期诊断具有挑战性,发现新的、有效的生物标记物是一个迫切的需求。

代谢组学可对生物样本多组分混合物进行定量分析,为理解生化网络的组成及功能提供重要信息,已经被应用于肿瘤标志物的识别、疾病治疗效果评价的研究中[6-7]。目前关于PTC代谢组学的研究主要集中在甲状腺癌各病理分型间,PTC与癌旁组织或与健康对照组血清的代谢组学研究[8-10]。关于PTC不同的生物学行为特征组(是否合并淋巴结转移,是否是微小乳头状癌)及PTC阶段性代谢特征鲜有报道。本研究对PTMC合并颈部淋巴结转移患者(T1组)、PTMC未合并颈淋巴结转移患者(T2组)、PTC合并颈部淋巴结转移者(T3组)、未合并颈部淋巴结转移患部者(T4组)、健康对照者(HC组)血清进行基于H-NMR技术代谢组学分析,通过非靶向代谢组学研究PTC的阶段化代谢特征谱,进行潜在生物标志物的筛选。

1 资料与方法

1.1 样品采集及制备 所用样品均采集自南京医科大学第二附属医院普外科自2018年1月至2018年12月期间手术的甲状腺癌患者和健康志愿者,均签署知情同意书。观察组纳入标准:经病理学证实的女性PTC患者,年龄18～65 岁。排除标准:既往有甲状腺疾病手术史;合并慢性淋巴细胞性甲状腺炎或甲状腺机能异常;有心血管疾病及其它内分泌代谢性疾病;肿瘤复发或者有其它恶性肿瘤患者;有代谢药物服药史及妊娠妇或处于哺乳期妇女。健康对照组为同期手术的甲状腺结节患者,采血时间为入院次日早晨。采集血样在常温下静置1 h后离心,4 ℃3 000 r/min,离心10 min,取上层血清置入冻存管,于-80 ℃冰箱保存。剔除样本量少或溶血样本。共获得PTMC合并颈部淋巴结转移患者(T1组)9例,平均年龄(42.3±5.8)岁;PTMC未合并颈部淋巴结转移患者(T2组)7例,平均年龄(41.9±7.3)岁;PTC合并颈部淋巴结转移患者(T3组)11例,平均年龄(42.9±6.3)岁;PTC未合并颈部淋巴结转移患者(T4组)5例,平均年龄(44.2±5.3)岁；纳入健康对照(HC)组10例，年龄(42.0±5.3)岁。五组年龄呈正态分布，方差齐，差异无统计学意义(F=0.148,P=0.963)。

1.2 血清1H-NMR检测 待测血清样本室温下解冻,取200 μl血清,加入485 μl甲醇/水(4/0.85, v/v)均匀后再依次加入200 μl三氯甲烷及225 μl水,充分涡旋后冰上静置10 min;以3 000 r/min离心10 min;吸取上层极性相,真空抽干后以备检测。取重水配置的磷酸盐缓冲液(100 mmol/L,pH=7.0)600 μl至编号后的EP样品管中,充分涡旋溶解后, 3 000 r/min离心10 min,取550 μl上清加入核磁共振管(直径:5 mm)中。H-NMR谱分析在Bruker AV 500 NMR谱仪上用5 mm PATXI 反向探头进行检测,对应的质子共振频率为500.18 MHz,其它参数如下:谱宽6 009.6 Hz,延迟时间0.3 s,混合时间0.1 s,线增宽因子1,累计扫描数128次,在弛豫延迟和混合期间采用预饱和照射压制水峰,获得的1H NMR谱图。利用TopSpin 2.1软件对谱图进行相位矫正和基线调整,其中TSP作为化学位移参考峰的内标,设为0 ppm。通过使用Chenomx Suite软件分析代谢物的化学位移来鉴定主要代谢物[11]。

1.3 数据处理及模式识别 利用ProMetabver 7.0软件(MathsWorks, Natick, MA, USA)对H-NMR谱进行基线调整及面积归一化处理,以TSP作为化学位移参考峰的位置,设为0 ppm,对化学位移(δ: 0.2～10.0)进行分段积分,将水峰所在的化学位移区域(δ:4.70～5.20)去除,积分间距为0.005 ppm。所得数据输入SIMCA-P+V11.0软件包(Umetric, Sweden)进行分析。采用有监管的偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)和正交校正的偏最小二乘法-判别分析(O-PLS-DA)分析方法对预处理的核磁图谱数据进行模式识别分析[11],以寻找具有显著特征的代谢物。

2 结果

2.1 对照组血清提取物的典型核磁共振氢谱 本实验共鉴定出30种代谢产物,如亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、酪氨酸,谷氨酸等氨基酸类化合物;Krebs循环中间体:琥珀酸;有机渗透调节物质:牛磺酸;储能物质:β-葡萄糖、α-葡萄糖等。结果见图1。

注：(1)异亮氨酸;(2)亮氨酸;(3)缬氨酸;(4)异丁酸;(5)乙醇;(6)3-羟基丁酸;(7)乳酸;(8)苏氨酸;(9)丙氨酸;(10)赖氨酸;(11)乙酸盐;(12)N-乙酰糖蛋白;(13)谷氨酸;(14)谷氨酰胺;(15)丙酮;(16)乙酰乙酸;(17)琥珀酸;(18)三甲胺;(19)肌酸;(20)磷酸肌酸;(21)胆碱;(22)磷酸胆碱;(23)牛磺酸;(24)甘氨酸;(25)β-葡萄糖;(26)α-葡萄糖;(27)酪氨酸;(28)组氨酸;(29)苯丙氨酸和(30)甲酸盐图1 健康对照组血液H-NMR谱图

2.2 核磁共振氢谱数据的多变量统计分析 O-PLS-DA结果表明PTC各组(T1、T2、T3、T4)与健康对照组(HC)组样本得分点显示出较好的分离趋势。和HC比较,T1组(合并颈部淋巴结转移的PTMC患者)9种差异性代谢产物:丙二醇、乳酸、赖氨酸、醋酸、N-乙酰蛋白、谷氨酸、肌酸、葡萄糖、甘氨酸水平显著升高(R2X=54.2%,Q2=0.690,见图2A, 2C); T2组(未发生颈部淋巴结转移的PTMC患者)有6种差异性代谢产物:丙二醇、醋酸、乙醇、葡糖糖、甘氨酸及组氨酸水平显著升高(R2X=49.1%、 Q2=0.580,见图2B、2D)。T3组(合并淋巴结转移的PTC患者)共10种差异性代谢产物,除了乳酸、赖氨酸、谷氨酸之外,更多的与肿瘤相关的代谢产物(如丙氨酸、酪氨酸)水平增高(R2X=81.3%、 Q2=0.609图3A、3C);此外, T4组(未发生颈部淋巴结转移的PTC患者)中检测到7种代谢产物:丙二醇、乙醇、乳酸、赖氨酸、N-乙酰蛋白、谷氨酸及肌酸代谢水平升高(R2X=61.2%、 Q2=0.661,见图3B、3D)。其中T3组的模型的解释度R2最高而T2组最低。

注：(1)丙二醇;(2)乳酸盐;(3)赖氨酸;(4)乙酸盐;(5)N-乙酰糖蛋白;(6)谷氨酸盐;(7)肌酸;(8)葡萄糖;(9)甘氨酸;(10)乙醇;(11)组氨酸图2 健康对照组与T1(A, C)、T2(B, D)组的H-NMR谱正交校正的偏最小二乘法-判别分析得分图和载荷图

注：(1)丙二醇;(2)乙醇;(3)乳酸;(4)丙氨酸;(5)赖氨酸;(6)N-乙酰糖蛋白;(7)谷氨酸;(8)葡萄糖;(9)未知;(10)酪氨酸和(11)肌酸图3 健康对照组与T3(A, C)、T4(B, D)组的H-NMR谱正交校正的偏最小二乘法-判别分析得分图和载荷图

3 讨论

代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一门新兴学科,可对生物体内的所有代谢物特别是小分子代谢物进行定性、定量分析[12-14]。代谢组学在肿瘤研究中占有重要地位,特定的代谢途径的激活,如有氧酵解和谷氨酰胺分解代谢,已在一些肿瘤疾病中被发现[15-16]。这些特定的肿瘤代谢物小分子的改变,参与恶性肿瘤的发展[17]。甲状腺肿瘤微环境中,乳酸是穿梭于癌细胞及间质细胞的重要代谢物质,作为重要的碳源参与细胞增殖同时也是肿瘤血管生成的信号分子之一。丙氨酸是肿瘤细胞的“必需氨基酸”。丙氨酸的生成可激活谷氨酰胺分解代谢途径,生成谷氨酸进入TCA循环,除了提供碳源,还提供氮源促肿瘤细胞增殖,激活肿瘤细胞信号转导通路。有研究者利用核磁共振光谱(NMR)或质谱技术,发现葡萄糖、氨基酸和脂类的代谢的产物在甲状腺恶性肿瘤与健康组织及癌旁组织相比较时出现代谢异常征[18-19]。但关于PTC不同行为特征组的代谢组学研究鲜有研究,尤其是PTMC。

本实验在基于1H-NMR构建高灵敏度的O-PLS-DA模型中可以看到,由于甲状腺肿瘤的存在这一主要因素导致了甲状腺癌各组与HC都有着明显的区分聚类趋势。在甲状腺癌发展的各个阶段,代谢产物的分布都发生了独特的变化,分别鉴定出9种、6种、10种和7种不同的代谢物。与HC比较,T2组(未合并颈部淋巴结转移的PTMC患者)的血清代谢轮廓更为接近HC。我们可以看到,合并颈部淋巴结转移的PTC患者(T3组)一些常见的肿瘤标志物如乳酸、谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸和酪氨酸水平增加,但是T2组,这些肿瘤相关的代谢产物未能鉴别出来。对于这一有趣的结果,需增加样本量进行进一步验证。

我们的研究结果初步表明,虽然不同阶段的PTC患者(T1、T2、T3、T4)组,各肿瘤组之间通过O-PLS-DA模型分析,未有明显的区分聚类趋势,可能由于样本量少及采用生物标本时是血清而不是组织标本。但是,HC与PTC各组间都得到了很好的区分,PTC在肿瘤发展的不同阶段具有不同的代谢特征,并鉴定出多种不同的代谢产物来区分HC和不同阶段的PTC患者,与报道的甲状腺癌[20]相关的肿瘤代谢特征一致。血清代谢组学对于PTC早期诊断、预防及治疗有参考意义。