盐胁迫下苜蓿父代与子一代种子萌发研究

王晓春，杨天辉 ，王 川，杨炜迪，陈彩锦

(1.宁夏农林科学院动物科学研究所，银川 750002;2.宁夏农林科学院固原分院，宁夏 固原 756000)

土壤的盐碱化在世界范围内广泛存在，包括盐碱化和次生盐碱化。如何开发利用现有的盐碱化土地资源是当今农业发展和社会可持续发展的一大热点。目前，有关盐碱化土地的开发和利用大致分为生物和非生物2种措施，生物措施较非生物措施在改良和利用盐碱地方面具有长效性和深度性。筛选、培育耐盐碱植物就是一种有效的生物措施。苜蓿(MedicagosativaL.)被称为“牧草之王”，具有产草量高、利用年限长、再生性强、适口性好、营养丰富等特点，其高效的生物固氮能力对盐碱地改良利用十分有益，还可以给畜牧业提供优质饲草。但是生产中一直缺少适于盐碱地栽培的耐盐碱苜蓿品种，筛选和培育耐盐碱能力强的品种对生态、经济等社会各个方面都具有重要意义。

耐盐碱新品种选育常见的方法有引种筛选、杂交、转基因等[1]。杨青川等认为，可以通过较大强度的耐盐胁迫进行选择与筛选，从而获得耐盐遗传变异材料[2]。尹国丽等研究表明，种子在逆境胁迫下能否正常萌发及幼苗生长良好是植物存活的前提条件，是在某一地区形成自然群落的关键因素[3]。刘卓等认为，单盐毒害比复盐大[4]。马春平等研究认为，低浓度NaCl溶液对苜蓿发芽势影响较小，不易进行耐盐性鉴定[5]。本试验在借鉴以上学者研究结果的基础上，以高浓度中性盐NaCl溶液对前期经低浓度盐溶液鉴定的商业种子(以下均称为父代种子)及其子一代种子(收种于盐碱地种植的优势单株)开展培养箱内的萌发期耐盐性鉴定、评价，比较不同品种两代种子的耐盐性，分析探讨苜蓿耐盐性的遗传变化规律，为筛选培育较耐盐的苜蓿新品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

15个苜蓿品种子一代种子来源于盐碱地种植第3年的优势单株(选择分枝数多、植株高大、叶片较大等特征)。盐碱地土壤以灰钙土、白疆土为主，盐渍化严重，肥力偏低。春季土壤pH=8.5，全盐5.4 g·kg-1。

1.2 试验方法

设置NaCl溶液浓度分别为0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，以蒸馏水为对照(0)，共5个梯度，每个梯度3次重复。种子需先经0.1%的升汞消毒10 min，蒸馏水冲洗3次，再经75%酒精消毒5 min，再用蒸馏水冲洗3次，控干水分备用。每个品种选取大小一致、颗粒饱满的50粒种子均匀放于铺有2层滤纸的培养皿(直径10 cm)中，每皿加入盐溶液10 mL，置于人工气候箱内(25 ℃恒温，光暗培养16 h/8 h)萌发。发芽期间采用称重法补水，每24 h补充每皿蒸发的水分，保持盐浓度不变。种子发芽以胚根露白为标准[6]，每天观察统计发芽情况，第10天结束试验。

1.3 测定项目及方法

发芽势(%)=(发芽胁迫试验第4天正常发芽粒数/供试种子粒数)×100%；

发芽率(%)=(发芽胁迫试验第7天正常发芽粒数/供试种子粒数)×100%；

苗长：胁迫第10天，从每皿随机选取10株，测量的幼苗拉直长度，

GI=∑Gt/Dt，Gt为第t天的发芽数，Dt为相应的发芽天数；

VI= GI×S，GI为发芽指数，S为一定时期内的幼苗长度[7-9]。

以上指标的相对值为处理值与对照的比值。

耐盐半致死浓度为相对发芽率为50%时的NaCl浓度，耐盐致死浓度为相对发芽率为10%时的NaCl浓度[10]。

表1 供试材料来源

1.4 耐盐性综合评价

苜蓿种子萌发期耐盐性采用模糊数学隶属函数法进行综合评价。隶属函数公式为：

X(μ)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，X为苜蓿某一萌发耐盐指标的测定值，Xmax和Xmin为该指标的最大值和最小值[11-13]。

以不同盐浓度胁迫下的相对发芽率、相对发芽指数、相对苗长、相对活力指数为耐盐指标，计算各项指标隶属函数值并排序，根据隶属函数值大小综合评价值不同品种两代种子的耐盐性，比较两代种子品种间的耐盐性大小，平均值越大，耐盐性越强，反之，耐盐性越弱。

1.5 数据统计及分析

试验数据用Excel软件进行统计分析，所有数值均以平均值表示，用SPSS 18.0分析软件对同一浓度下不同品种和同一品种不同浓度间各指标进行差异显著性分析(Duncan法)。

2 结果与分析

2.1 苜蓿父代种子与子一代种子发芽率、硬实率的分析比较

由图1可见，所有供试品种父代种子的发芽率都高于子一代种子，硬实率都低于子一代种子，发芽率的高低由种子硬实影响。苜蓿种子硬实是一种普遍存在的现象[14]。本试验中两代种子都存在硬实情况，但两代种子硬实率差异明显。父代种子的硬实率极低，平均硬实率仅为1.4%，对发芽结果影响很小。子一代种子硬实率普遍较高，远远高于父代种子，最高的种子硬实率达到42.8%。子一代种子的硬实率对发芽结果的影响较大。

图1 苜蓿各品种父代种子与子一代种子发芽率、硬实率比较

2.2 高浓度盐胁迫下苜蓿父代种子及其子一代种子相对发芽势、发芽率的分析比较

发芽势反映了种子的发芽速度和整齐度，主要测试种子生命力的强弱。因为种子硬实的影响，以相对发芽势、发芽率评价种子的发芽能力。供试的15个苜蓿品种父代种子及其子一代种子在高浓度盐胁迫下，随着NaCl浓度的升高，相对发芽势均下降。在0.8%NaCl胁迫下，父代种子大多数品种依然保持着较高的发芽势，除了3个品种，相对发芽势都在80%以上，其中有7个品种相对发芽势高于90%。而子一代种子的相对发芽势，大于80%的有9个品种，高于90%的只有1个品种；在1.0%NaCl浓度胁迫下，父代种子相对发芽势在80%以上的有6个品种，其中南苜501、中苜1号的相对发芽势依然在95%左右。而子一代种子相对发芽势保持在80%以上的只有阿迪娜和德国大叶2个品种，其中有3个品种的相对发芽势只有13.1%、14.6%和0。子一代种子大多数品种(11个)的相对发芽势与上一浓度梯度相比，急剧下降，最高的下降了84.6%，下降幅度大于父代种子。在1.2%NaCl胁迫下，父代种子依然有9个品种保持相对较高的相对发芽势，有4个品种相对发芽势低于50%。而子一代种子相对发芽势高于50%的只有3个品种，且值偏低，其余12个品种相对发芽势则更低；在1.4%NaCl胁迫下，父代种子相对发芽势除了中苜1号(79.5%)和DS 310 FY(68.3%)的较高外，其余13个品种的相对发芽势都低于50%，其中高于10%的有8个品种，而子一代种子低于10%的有11个品种，其余4个品种相对发芽势维持在10%～20%之间。归纳得出：有2个品种的子一代种子高于父代种子；有2个品种的2代种子的相对发芽势差异不显著；有1个品种在0.8%NaCl浓度下，父代种子略低于子一代，但在1.0% NaCl浓度胁迫下，又低于父代种子。由此可见，在同浓度盐胁迫下，多数品种子一代种子相对发芽势低于父代种子，并且差距较大。

种子的发芽率是苜蓿萌发期耐盐能力的直接表现，是衡量苜蓿耐盐性的关键指标。各品种父代种子及其子一代种子相对发芽率变化规律同相对发芽势。在0.8%的NaCl浓度胁迫下，供试品种的父代种子相对发芽率都保持在87%以上，比绝大多数子一代种子(9个品种)相对发芽率高，而子一代种子相对发芽率均值为76.9%；在1.0%的NaCl浓度胁迫下，各品种父代种子相对发芽率均值下降为80.1%，子一代种子仅为42.9%，下降幅度远远大于父代种子。子一代种子相对发芽率低于50%有10个品种，而父代种子只有1个品种，可见，1.0%NaCl浓度是子一代大多数品种的半致死浓度；在1.2%的NaCl浓度胁迫下，父代种子相对发芽率均值下降为62.6%，子一代种子仅为29%。相对发芽率低于50%的父代种子有4个品种，子一代品种有13个；在1.4%的NaCl浓度胁迫下，父代种子相对发芽率平均为37%，其中有3个品种相对发芽率依然较高。而子一代种子平均相对发芽率只有9.5%。可见，1.4%的NaCl浓度是父代种子大多数品种(11个)的半致死浓度，是子一代种子大多数品种(10个)的致死浓度。在各个盐浓度下，各品种两代种子相对发芽率变化无对应关系。

2.3 在高浓度盐胁迫下，胁迫时间对苜蓿父代种子及其子一代种子萌发的影响

盐胁迫抑制苜蓿种子的萌发时间。无盐胁迫下(0)，两代种子15 h后均有种子萌发，但随盐浓度升高，种子萌发时间依次推迟。在相同盐浓度下，父代种子各品种7 d时的相对发芽率比4 d时的相对发芽率(势)有增加或不变，说明种子依然有活力。但随着胁迫时间的增加(≥7 d时)，在高浓度盐的胁迫下，已发芽的苗都会出现不同程度毒害表现，苗较长的植株出现根断、干或腐软等现象(图2)，芽较短的苗则表现出发软等失活现象(图3)。随着盐浓度和胁迫时间的增加，受毒害的苗比例会增加。当胁迫10 d时，苗较长的植株，虽然根断或根失活，但部分苗看起来还有生活力，一旦解除盐胁迫，会从根颈处发出新的侧根，从而恢复生命力。而较短的幼苗或幼芽则会完全变软失活，死亡。

图3 芽较短的种苗在高浓度盐胁迫下发软、失活

图2 健壮植株的根在高浓度盐胁迫下干、断或腐软

子一代种子发芽形态变化与父代种子相同，但耐受盐胁迫的时间更短。5 d时，毒害作用就开始显现，尤其是在芽较短的苗上。子一代种子有的品种在7 d时的相对发芽率比4 d时的相对发芽率(势)低，也验证了这个结果。随着胁迫时间增加，子一代种子比相同浓度、胁迫时间的父代种子受到的毒害作用更大，因为子一代种子的苗弱于父代种子，所以耐盐能力就弱于父代种子。而相同胁迫浓度、时间下幼苗的强弱可以通过苗长反映。实际生产大田土壤的盐度也是变化的，会随着降雨或者灌水等有所下降，所以评价苜蓿种子的耐盐能力也应该结合苗的长势(苗长)。

2.4 苜蓿父代种子及其子一代种子在高浓度盐胁迫下苗长的分析、比较

10 d时，测量已发芽幼苗的胚根、胚芽长度时，发现在设置的4个盐浓度胁迫下，胚轴较长的苗都有胚根断或腐的情况存在，但部分苗还有活力，可以发出新的侧根，所以以未失活苗整个苗长数据比较不同品种的两代种子的耐盐能力，而不是传统的胚根。苗长越长，其耐盐能力就相对较强。当NaCl浓度为1.2%时，子一代种子发芽苗基本全部失活，无有效苗长数据。而在1.4% NaCl浓度下，父代种子多数品种发芽幼苗也多数失活，数据不具有普遍性，为无效数据。统计结果见表2。

由表2可见，随着NaCl浓度的增加，各品种父代及其子一代发芽的幼苗生长均受到抑制，长度逐渐下降。在0.8%NaCl浓度胁迫下，与对照(0)相比，在1.0% NaCl浓度胁迫下与0.8% NaCl浓度胁迫相比，均表现为苗长下降，子一代种子苗长下降幅度大于父代种子。NaCl浓度为1.2%时，父代种子有3个品种的苗受到盐溶液毒害，多数失活，但其他品种已发芽苗里大多数苗依然有活力，而子一代发芽苗则全部失活。且父代种子发芽苗大于30 mm的品种有4个(盐宝，德国大叶，耐盐，中苜1号)。可见，在不同盐浓度胁迫下，两代种子已发芽苗长在品种上无对应关系。

表2 各苜蓿品种父代种子与子一代种子在高浓度NaCl胁迫下的苗长 单位：mm

2.5 苜蓿父代种子及其子一代种子萌发期耐盐性综合评价

以隶属函数值对两代种子萌发期耐盐性进行综合评价(表3)，通过排序得出父代种子耐盐性由大到小品种依次为：DS 310 FY，中苜1号，耐盐，德国大叶，南苜501，盐宝，中苜3号，陇东，皇后2000 R，岩石，阿迪娜，三得利，甘农3号，龙牧801，WL 343 HQ，这个结果与在较低盐浓度下的鉴定结果基本一致[15]；子一代品种依次为：德国大叶，WL 343 HQ，耐盐，盐宝，阿迪娜，龙牧801，岩石，皇后2000 R，三得利，南苜501，中苜3号，中苜1号，甘农3号、DS 310 FY，陇东。两代种子耐盐能力品种间无对应关系(|r|<0.3)。

表3 苜蓿各品种父代种子与子一代种子萌发期耐盐性各指标隶属函数值及综合评价值

3 讨 论

3.1 高浓度盐对苜蓿种子萌发的影响

本研究参考王晓春等[16]的方法，以0.8%NaCl浓度为起点，开展苜蓿父代种子及其子一代种子耐盐胁迫鉴定比较试验。两代种子在发芽率上差异明显，子一代种子发芽率远远低于父代种子，这个差异是由子一代种子具有较高的硬实率造成的。目前，对于种子硬实现象成因的定论说法不一，形成的原因尚无确切定论[17]。但因本试验中子一代种子采自盐碱地苜蓿植株，土壤盐碱度都较高，且较贫瘠，所以分析土壤条件不良是造成子一代种子硬实率高的可能原因。

随着NaCl胁迫浓度的升高，苜蓿父代种子及子一代种子的相对发芽势、相对发芽率、苗长等指标均下降，但子一代种子下降的幅度比父代种子大，并且在相同盐浓度胁迫下，绝大多数父代种子的相对发芽势、相对发芽率、苗长高于子一代种子，说明父代种子比子一代种子更耐盐，并且子一代种子与父代种子耐盐性在品种间无相对应的变化关系。这个结果有可能是品种内个体差异引起，因为本试验子一代种子均为单株种，而父代种子为混合种。杨青川等研究表明：苜蓿品种间耐盐性差异不显著，而品种内植株差异明显[2]。可能因为子一代种子是单株种子，不能代表子一代种子品种共性。

3.2 高浓度盐胁迫下胁迫时间对苜蓿种子萌发的影响

在高浓度NaCl胁迫下，随着胁迫时间的增加，很多已发芽苗出现根断、腐等受毒害表现，说明盐胁迫对根的伤害大于芽、茎，这与王静等[18]的试验结论一致。目前虽然已有大量的有关苜蓿萌发期耐盐胁迫的研究，但关于多长时间苗开始受到盐溶液毒害及毒害作用机理的研究报道却相对较少。相同胁迫时间对生活力强的种子毒害作用小于生活力弱的种子。在相同盐浓度胁迫下，子一代种子相对发芽势低于父代种子，子一代种子发芽苗弱于父代种子发芽苗，受毒害的程度更重，失活种子比例多于父代种子。说明在相同盐浓度、胁迫时间下，子一代种子的耐盐能力弱于父代种子。

3.3 苜蓿耐盐性的探究

在高浓度盐胁迫下，受盐毒害影响较小、耐受时间长或者成活的材料就是育种家要筛选的突变或者耐盐材料。这种耐盐种质是培育耐盐品种的重要材料基础。提高苜蓿的耐盐性，对耐盐种质及变异材料筛选十分必要。植物种子萌发和幼苗生长是植物生长最脆弱的阶段，对土壤盐碱的影响最敏感，随着根系及植株的生长发育，耐盐碱能力逐渐增强，所以这个阶段是植物建植成败的关键时期[19,20]。本试验选择萌发期，以盐碱地生产性状突出的苜蓿植株的后代，和父代种子开展不同品种的种子耐盐(NaCl)胁迫，结果表明，子一代种子的耐盐性差于父代种子，并且两代种子品种在耐盐性上无对应关系。杨青川等认为，苜蓿具有通过选择增加耐盐性的遗传潜力，经过数代选择，势必会增加群体的耐盐性[2]。但本试验结果却反映子一代种子在耐盐性上不但没有超过父代种子，还较父代种子差。苜蓿耐盐性属于数量遗传，受基因与环境的影响[21]。本试验选择的材料是盐碱地里健壮突出的单株，经开放授粉后收种，主观上侧重于生产性状。但在大田栽培中，抗逆性与丰产性通常成反比，侧重于生产，势必会影响抗逆性的筛选，从而造成子一代种子的耐盐遗传能力不突出。其次两代种子来源地不同，子一代种子来源于盐碱重，较贫瘠，地力差的大田，而父代种子为商业种子，采收于种子田，这种差距势必会造成子一代种子生活力弱于父代种子。而生活力强的种子抵御盐碱毒害的能力更强，更耐盐，国内外都已有报道[22,23]，证实施肥可以增加作物的耐盐性。

4 结 论

对两代种子15个品种开展萌发期耐盐胁迫，通过对各耐盐指标的分析、比较，得出子一代种子耐盐性弱于父代种子，并且耐盐性在品种间无对应关系。苜蓿耐盐遗传潜力主要受遗传背景的多样性、生理过程的复杂性、逆境因子的多变性及各种因素的相互作用的综合影响，要掌握苜蓿耐盐遗传潜力，必须从苜蓿种子的背景来源，生长的不同阶段的耐盐性，以及大量的材料，开展几个世代系统的深入研究。