采前喷施纳米钛提升冷藏杨梅品质及其通径分析

孙志栋 焦 云 李共国 史婷婷

(1宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040；2浙江万里学院宁波市农品加工技术重点实验室，浙江 宁波 315100)

杨梅(Myrica rubra)为我国南方特产水果，果实酸甜多汁，风味浓郁。杨梅成熟季节正逢酷暑，加上采收集中、时间短以及采后杨梅极易发霉变质，杨梅的贮运保鲜一直是研究热点[1]。纳米二氧化钛(TiO2)是一种光催化型抑菌剂，无毒、无味、化学性质稳定，具有很强的氧化性和抑菌、除臭功效[2]。TiO2能利用紫外光降解多种有害的有机物，在净化污水、空气以及防污自洁和抗菌杀毒等领域广泛应用[3]。纳米TiO2对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[4]、大肠杆菌(Escherichia coli)[5]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[6]、青霉菌(Penicillium)[7]等具有一定的抑制作用。因此，纳米TiO2的复合溶液常用作果蔬保鲜剂，如含纳米TiO2的复合溶液处理双孢蘑菇可以较好地改善其色泽，延缓开伞[8]。前人研究表明，纳米TiO2多作为涂膜添加剂或复合包装膜的抑菌成分用于易腐果蔬的保鲜，如桃[9]、草莓[10-11]、梨[12]、金针菇[13]、番茄[14]、胡萝卜[15]等，其原理是纳米TiO2的光催化性可以将果蔬产生的乙烯氧化分解成二氧化碳和水，同时纳米TiO2在光照射下产生氧化性较强的活性自由基，可以抑制微生物的生长甚至杀死微生物[16]。纳米TiO2的光催化特性不仅能明显促进光能的吸收、并将其转换为电能及活跃的化学能，还能促进CO2的同化[17-18]。但有关纳米TiO2溶液对果树进行采前喷施，促进其果实品质提高、增强耐贮性的研究尚鲜有报道。TiO2是一种多相混合物，有金红石型、锐钛矿型和板钛矿型三种形态，其中，金红石型TiO2化学性能稳定，具有较好的光散射和反射性能，因而光催化性能良好[19]。为此，本研究设计了杨梅采前喷施金红石纳米TiO2试验，考察杨梅在冷藏期间的果实品质及生理生化等指标的变化，并采用逐步回归和通径分析法，揭示杨梅果实品质、生理生化等指标与好果率之间的关系，以期为杨梅的保鲜提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

本试验选用浙江慈溪市温室大棚栽培树龄、树势及挂果量一致的荸荠种杨梅。

金红石纳米TiO2(60 nm 和40 nm)均为分析纯，上海Aladdin 公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TA.XT Plus 物性分析仪，英国Stable Micro Systems公司；SYNAPT G2 液质联用色谱仪，美国Waters 公司；PAL-1 数显糖度仪，日本ATAGO 公司；MS105DU 精密天平，瑞士Mettler Toledo 公司；YP30002 电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；DK-S24 电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；UV756P 紫外分光光度计，上海赫尔普国际贸易有限公司；H1850R 离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KQ2200DE 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 试验方法

研究表明，纳米TiO2只有在吸收一定紫外光后，才能通过价带电子的能级跃迁，产生空穴，继而产生活性自由基，发挥抗菌功能，且粒径为30 ～40 nm 的纳米TiO2对紫外线有良好的吸收性能[16]。此外，当纳米TiO2质量分数达到0.10%时，即可对寄生于水果中的青霉菌、绿霉菌及大肠杆菌具有较高的活性抑制能力[20]。结合预备试验的经验，当喷施的纳米TiO2溶胶质量分数达到0.25%时，白色乳液易在杨梅树叶上残留较长时间，影响杨梅的观光休闲采摘。本试验最终设置喷施金红石纳米TiO2的粒径和浓度水平如表1所示。共设5 个处理，4 次重复，喷施时间为5月23日下午(晴天)，自上而下喷施一次，采摘时间为5月31日上午(晴天)，每处理采摘样品2 框，每框2 kg。

表1 采前喷施金红石纳米TiO2 的试验设计Table1 Experimental design of pre-harvest spraying rutile TiO2

试验流程:挑选受试杨梅株→采前喷施金红石纳米TiO2溶液→采收、取样→4℃预冷12 h→0 ～4℃冷藏20 d，每隔5 d 取样1 次，共取样4 次，考查果实商品果率、硬度、可溶性固形物(total soluble solid，TSS)含量、可滴定酸(total acid，TA)含量、还原糖(reducing sugar，RS)含量、维生素C(vitamin C，Vc)含量。

1.4 指标测定方法

杨梅硬度采用物性分析仪测定，传感器端面直径5 mm，移动速度1.0 mm·s-1，压缩距离5 mm，以压缩时受力的最大峰值表示硬度[21]。

TSS 含量采用数显糖度仪测定。

用酸碱滴定法测定TA 含量。

用碱性酒石酸铜溶液直接滴定法测定RS 含量。

用2，6-二氯酚靛酚法测定Vc 含量[22]。

参照文献[23]的方法测定羟自由基(·OH)清除率。

参照文献[24]的方法测定多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)和过氧化物酶(peroxidase，POD)活性，酶活性均以每克鲜样每分钟吸光度变化0.01 为1 个酶活性单位，表示为U·min-1·g-1。

杨梅的好果率和发霉率分别按好果数量和发霉果数量占总果数量的百分比进行统计。裂软果率按裂、软果数量占总果数量的百分比进行统计。

1.5 数据处理

冷藏杨梅品质与因子间的通径分析:逐步回归分析分别以杨梅好果率、发霉率以及裂软果率为因变量(y)，以果实的硬度、TSS、TA、RS 和Vc 含量等品质指标，以及·OH 清除率、POD 和PPO 活性等生理生化指标为自变量(x)[25]，分析上述指标对杨梅好果率、发霉率、裂软果率的影响。对入选多元回归方程的自变量因子，作进一步的通径分析，即将自变量与因变量之间的相关系数分解为直接通径系数和间接通径系数，通过比较各因子通径系数绝对值的大小，确定各自变量对因变量产生显著影响的主次顺序[26]。同时，引入影响杨梅好果率的决策系数(计算公式:2×相关系数×直接作用系数-直接作用系数2)概念，通过计算各自变量对因变量作用的决策系数，确定因变量的主要决策变量(决策系数为最大正值)，以及引起因变量波动的限制变量(决策系数为最小负值)[27]。以上分析均应用DPS 10.15 数据处理系统完成。采用Word 97-2003 制图。

2 结果与分析

2.1 冷藏期间杨梅品质的变化

由图1可知，贮藏期20 d 内60 nm、0.10% TiO2处理组杨梅果实的平均裂软果率(3.4%)明显高于CK(0.8%)和0.05%TiO2处理组(0.0%)(图1-A)；40 nm、0.10% TiO2处理组杨梅平均发霉率(6.1%)明显低于CK(20.6%)、40 nm、0.05% TiO2处理组(29.5%) 和60 nm、0.10% TiO2处理组(19.3%)(图1-B)。40 nm、0.10%TiO2处理组杨梅果实的硬度最高，明显高于60 nm、0.05%TiO2处理组(图1-C)；TSS 含量则明显低于60 nm TiO2处理组(图1-D)；RS含量明显低于0.05% TiO2处理组(图1-F)；TA 含量最高，明显高于CK 和40 nm、0.05% TiO2处理组(图1-E)；Vc 含量最高，·OH 清除率最低(图1-G、H)。杨梅经采前喷施金红石纳米TiO2后，POD 和PPO 活性均较CK 有不同程度的下降(图1-I、J)。40 nm、0.10%TiO2处理组和60 nm、0.05% TiO2处理组杨梅的好果率分别较CK 高14.5 和4.8 个百分点。由于冷藏试验各组杨梅的初始TSS 含量不同，即成熟度不同，导致冷藏杨梅品质的差异较大。CK 杨梅在冷藏初期10 d成熟度最低，但在冷藏过程中TSS 含量不断升高，后熟速度快，硬度下降明显，且冷藏10 d 发霉率高达20%；60 nm、0.05% TiO2处理组由于杨梅早熟，应适当缩短冷藏期，冷藏15 d 时杨梅的发霉率比CK 低9.5 个百分点，但发霉率已达17.2%；而40 nm、0.10% TiO2处理组冷藏杨梅TSS 含量波动不大，后熟现象不明显，冷藏15 d 时发霉率仍控制在7.5%以下，比CK 低19.5个百分点。

图1 采前喷施金红石纳米TiO2 对冷藏杨梅品质的影响Fig.1 Effect of pre-harvest spraying rutile TiO2 on quality of cold storage Myrica rubra

2.2 杨梅好果率、发霉率以及裂软果率的多元逐步回归与通径分析

由表2可知，杨梅果实好果率、发霉率、裂软果率与果实品质指标之间的逐步多元回归方程均通过了显著性检验(n＝20，R≥0.686，P≤0.014 9)。鉴于果实品质与生理生化指标变量对杨梅好果率、发霉率、裂软果率的直接影响和综合影响排序可能不同，为检出重要指标以便分析，引入决策系数，从而确定主要决策变量和限制变量[25]。从影响冷藏杨梅好果率、发霉率以及裂软果率的重要因子及其决策系数看，RS 含量是冷藏杨梅好果率变化最大的决策因子，决策系数为0.428，TSS 含量是冷藏杨梅好果率和发霉率波动的限制因子，限制系数分别为-0.356 和-0.318。另外，TA含量分别成为冷藏杨梅发霉率和裂软果率变化的主要决策因子。

表2 冷藏期杨梅好果率、发霉率与果实品质指标之间的多元逐步回归方程Table2 Multiple stepwise regression equations between good fruit rate，mildew rate of Myrica rubra and fruit quality index in the cold storage period

为探究上述决策因子和限制因子对杨梅好果率的作用机理，进一步对其作通径分析。由表3可知，影响冷藏期杨梅好果率(发霉率)最大的直接作用因子均为RS 含量，作用系数为-0.824 (0.720)；影响冷藏期杨梅好果率(发霉率)最大的间接作用总和均为TSS含量，作用系数为-0.623 (0.593)，其主要通过积累RS 对杨梅好果率(发霉率)产生较大的间接负向(正向)作用，作用系数达-0.501 (0.438)。尽管TSS 含量对杨梅好果率(发霉率)的直接作用系数为正向(负向)的0.444 (-0.410)，但其综合作用效果相反-0.179 (0.183)。

果实RS 含量对杨梅好果率的决策系数为最大的正值[偏相关系数r(y，RS)＝-0.747，P＝0.000 6]，成为影响杨梅好果率的主要决策因子；而TA、RS 含量对杨梅发霉率的决策系数均为较大的正值[偏相关系数r(y，TA)＝-0.663，P＝0.003 4；r(y，RS)＝0.704，P＝0.001 4]，共同构成了杨梅发霉率的主要决策因子；TSS 含量对杨梅好果率[偏相关系数r(y，TSS)＝0.529，P＝0.029 1]和发霉率[偏相关系数r(y，TSS)＝-0.503，P＝0.038 7]的决策系数均为最小的负值，同时成为杨梅好果率和发霉率波动的限制因子。

由表4可知，影响冷藏期杨梅裂软果率最大的直接作用因子是TA 含量，作用系数为0.597，其次为RS 含量，作用系数为0.481，但后者通过TA 发生较大的负向间接作用，致使RS 含量对杨梅裂软果率的综合作用效果在3 个变量中为最小，·OH 清除率的综合作用效果仅次于TA 含量。果实TA 含量的决策系数为最大的正值[偏相关系数r(y，TA)＝0.599，P＝0.008 2]，成为影响杨梅裂软果率的主要决策因子。

表3 冷藏杨梅好果率(发霉率)与主要品质指标通径分析结果Table3 Results of path analysis between good fruit rate (mouldy fruit rate) of Myrica rubra and fruit quality index in the cold storage period

表4 冷藏杨梅裂软果率与主要品质指标通径分析Table4 Correlation and path analysis between fissure，soft fruit rate of Myrica rubra and fruit quality index in the cold storage period

3 讨论

3.1 喷施纳米TiO2 对杨梅成熟度和冷藏品质的影响

聂磊[18]研究发现，在污染空气条件下，喷施纳米TiO2溶胶能净化空气以减轻植物叶片细胞质膜的透性，降低膜脂过氧化水平，增加叶绿素含量，提高植物光合作用速率，并以0.4%浓度预处理的效果最好。苏明玉[28]研究表明，用适当低浓度纳米TiO2处理波菜，可增强其对可见光的吸收能力，并提高菠菜光系统Ⅱ的光化学活性，加快水的光解和氧气释放。本研究发现，杨梅采前1 周经金红石纳米TiO2溶胶喷施后，采摘时所有处理组的TSS 含量均明显高于CK，其中60 nm 粒径处理组的TSS 含量高于40 nm 粒径处理组，可能是大颗粒的金红石纳米TiO2具有较好的光散射和反射性能，因而能提高光能的利用率[19]。由此可见，喷施纳米TiO2溶胶可促进杨梅早熟，提前采收，且在试验过程中也发现喷施组的杨梅转色早，颜色更红紫。此外，祝钧等[16]认为，纳米TiO2在粒径为30 ～40 nm 时，对600 nm 波长以内的紫外线有良好的吸收特性。苏明玉[28]研究表明，纳米TiO2颗粒粒径越小，杀菌效果越好，其光催化杀菌作用在光照结束后的一段时间内仍有效。龙小艺等[20]研究发现，当纳米TiO2质量分数达到0.10%时，已对寄生于南丰蜜桔的青霉菌、绿霉菌及大肠杆菌具有较高的活性抑制能力；而刘艳辉[29]研究认为，低浓度纳米TiO2对真菌的杀灭率不明显，这是由于真菌的细胞壁和细胞膜明显比细菌的厚。由此解释了本试验中小颗粒、高浓度的TiO2处理组(40 nm、0.10%)具有最好的杀灭霉菌作用。鉴于杨梅保鲜过程中最大的问题是由霉菌引起的发霉，采前喷施40 nm、0.10%金红石纳米TiO2抑制杨梅发霉效果明显，基本达到了果蔬保鲜生产的商业要求，是较理想的采前保质措施。本试验还发现，当纳米TiO2浓度不足以及时杀霉时，会引起霉菌的大量滋生，如40 nm、0.05%TiO2处理组反而起到了诱导微生物生长繁殖的作用，还需要后续进一步的研究分析。

3.2 纳米TiO2 处理提升冷藏杨梅品质的机制分析

采后果蔬仍然有呼吸代谢，在冷藏过程中，组织中复杂的有机酸分解成简单分子的代谢物，或大分子淀粉水解转化为小分子糖。同时，微生物生长代谢产生的酶系将多糖等非还原糖转化为RS[30]，促使TSS 和RS 含量均呈上升趋势，且二者之间具有极显著正相关性[31]，这是果实后熟、衰老的生理特征。本试验结果表明，40 nm、0.10% TiO2处理组能延缓冷藏期杨梅TSS 和RS 含量的上升，缓解果实中复杂物质的分解，且二者之间也有明显的正相关性。通径分析结果表明，RS 含量是直接影响冷藏期杨梅好果率(发霉率)最大的直接作用因子，最大的间接作用总和均为TSS含量，并且TSS 主要通过RS 的积累对杨梅好果率(或发霉率)产生较大的间接负向(或正向)作用。可见，40 nm、0.10% TiO2处理组成功阻断了杨梅的微生物生长代谢，这与具有广谱抑菌功能的OAA-7 复合保鲜剂的作用机制相似[32]。从果蔬的生理活性反应来看，采后果蔬组织受到逆境胁迫或病菌侵染时，PPO活性会快速上升来保护果蔬组织，而POD 活性可以衡量系统清除自由基能力，是果蔬衰老的重要指标之一[33]。纳米TiO2光催化杀菌主要依靠催化剂表面所产生的氧化基团，如O2-、H2O2和·OH 等，并以·OH氧化性最强[28]。本研究中，CK 杨梅的PPO、POD 活性均最高，说明受到病菌侵染的胁迫作用最强，而40 nm、0.10% TiO2处理组的·OH 清除率最低，可能是由于外源·OH 具有净化空气环境和对杨梅表面杀菌等作用，消除了病菌侵染对杨梅抗氧化系统的诱导。张萍等[34]和李博等[35]研究表明，纳米TiO2处理能提高叶片净光合速率，显著促进叶片植物光合作用速率的增加，导致叶片水分的消耗也增加，如果叶片水分供应不足，会造成叶果争水现象，这可能也是本试验高浓度TiO2处理组杨梅有少量裂果的主要原因之一；另外，由于纳米TiO2光催化杀菌是通过对“水的光解”完成的，杨梅组织失水后也会引起开裂。由本研究的发霉率和裂软果率来看，虽然高浓度TiO2处理组杨梅有裂果现象发生，但发霉率比CK 明显下降，如40 nm、0.10%TiO2处理组杨梅冷藏15 d 裂软果率比CK 高0.5 个百分点，而发霉率比CK 低19.5 个百分点，这在农业生产上是可接受的。

4 结论

综上，采前喷施大颗粒、低浓度(60 nm、0.05%)的金红石纳米TiO2可提高杨梅对光能的利用率，有利于杨梅早熟；喷施小颗粒、高浓度(40 nm、0.10%)的金红石纳米TiO2有助于杨梅的表面杀霉，提高杨梅的贮藏性能。TiO2处理浓度过高会导致杨梅发生裂果，TiO2处理浓度过低又会起到诱导微生物生长繁殖的作用。RS 含量是影响冷藏杨梅好果率的主要决策因子，TSS 含量是影响杨梅好果率波动的限制因子，主要通过积累RS 发挥间接的负向作用。TA 含量是影响冷藏杨梅发霉率和裂软果率的主要决策因子。本研究结果为促进杨梅早熟以及提高其冷藏性能提供了思路。