稳定碳、氮同位素在牛肉加工过程中的分馏效应

包小平 贺媛媛 孙倩倩 魏益民 郭波莉

(中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193)

牛肉因其高蛋白质、低脂肪以及含有人体所需的各种营养素，如维生素、氨基酸和矿物质等受到消费者的青睐[1]。目前我国已是世界第三大牛肉生产国[2]，国内外销量逐渐增长。食品来源地与其品质和质量安全密切相关。2006年欧盟针对地标农产品认证制定了3 种标签，原产地名称保护(protected denomination of origin，PDO)、地理标志保护(protected geographical indication，PGI)、传统特色保证(traditional specialty guaranteed，TSG)[3]。2007年我国制定了《农产品地理标志管理办法》以规范和促进我国名优特地理标志农产品的品牌建设[4]。

在全球化和国际食品贸易的背景下，一些不良商家受经济利益驱使，常以一般牛肉冒充名优、特色的地理标志牛肉产品，致使市场秩序混乱，消费者合法权益受损。因此，急需科学的技术手段在牛肉原料生产、加工、储藏、流通等环节进行检测和监测，提高特色、优质牛肉产品产业链的质量安全监管水平，保护消费者的合法权益，增加消费者对牛肉产品的信心。

稳定同位素指纹分析是动植物食品产地溯源中非常有效的方法之一[5-6]，已被广泛应用于酒类[7-8]、蜂蜜[9-10]、果蔬[11-13]、粮油[14-16]、乳制品[17-18]以及肉类[19-21]等食品的产地溯源。前期稳定同位素分析技术主要用于农产品的产地溯源，随着研究的不断深入，国内外专家开始探讨其对加工制品原料产地溯源的可行性。研究发现，意大利面生产链中从小麦制成面粉再加工成意大利面的各环节中稳定碳、氮、氢、氧同位素比率差异变化分别小于0.1‰、0.1‰、1.0‰、0.2‰，表明稳定同位素在加工过程无显著变化[22]。另一项研究通过测定75 min 发酵面包样品以及190℃烘焙前后糖饼干样品的δ13C、δ15N 值发现，烘烤前后糖饼干及酵母面包的δ13C 或δ15N 值无显著变化，认为烘焙和发酵2 种常见的食品加工技术基本不影响谷物食品的碳、氮稳定同位素特征[23]。也有研究发现，乙醇和香草醇在蒸馏过程中δ13C 均显著分馏[24-25]，因此在加热或蒸发等过程中化学物质中稳定同位素会发生一定的分馏效应。另有研究表明，尽管5 种不同烘干方式对西湖龙井茶稳定碳、氮、氢、氧同位素比率组成有一定影响，但结合数理统计方法仍可准确追溯同一产区不同烘干方式的西湖龙井茶[26]。不同烹饪方法(煮、烤、蒸)会改变鱼肉组分含量及比例，但稳定碳、氮同位素分馏＜1‰，鱼骨中的稳定碳氮同位素值在烹饪过程中无显著变化[27]。煮制、烤制和煎制前后牛肉中稳定碳、氮同位素无显著差异，且聚类分析结果表明，加工和未加工的牛肉按不同地域均被明确分类[28-29]，但上述研究仅比较了生、熟牛肉之间的同位素差异，不同加工时间对牛肉稳定同位素组成的影响，以及加工副产物(汤渣、烤渣、炸油)中稳定同位素的变化尚不清楚。本研究在前期研究的基础上，进一步探索牛肉稳定碳、氮同位素的分馏效应，旨在确证其在牛肉加工半成品及成品原产地溯源应用的稳定性和有效性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2017年3月分别从内蒙古呼伦贝尔市和吉林长春市2 个地点采集2 种不同饲养方式的牛肉，各采集8 kg 后腿部位牛肉，于-18℃冷冻保存待用。样品分为两部分，一部分作为对照原料样品，另一部分用于水煮、烤制和油炸3 种典型的烹饪加工，并收集加工样品和加工副产物，提取牛肉不同组分用于后续试验。具体烹饪加工试验流程如图1所示。

图1 加工试验流程图Fig.1 The flow chart of beef sample preparation

1.2 主要仪器与设备

ALPHA1-2LD plus 真空冷冻干燥机，德国CHRIST公司；QM-3SP2 行星式球磨仪，南京大学仪器厂；MG-17AC-000AC 电烤箱，佛山顺德区美的微波电器制造有限公司；IsoPrime100 同位素比率质谱仪，英国IsoPrime 公司；Conflo Ⅲ稀释仪，英国IsoPrime 公司；Vario PYRO 元素分析仪，德国Elementar 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 未加工样品处理方法 取100 g 样品，切成1 cm×1 cm×1 cm 的小块，采用真空冷冻干燥机冷冻干燥60 h，干燥完成后用球磨仪研磨，并采用石油醚(60～90℃沸程)进行4 h 脱脂处理，提取脱脂牛肉和粗脂肪，保存待用。

1.3.2 加工样品处理方法

1)水煮试验。取100 g 牛肉样品，沿肌纤维垂直方向切成1 cm×1cm×1 cm 的肉块，置于1 000 mL 圆底烧瓶，加水600 mL，装回流装置。依据预试验中牛肉沸水煮熟需要30 min，设定沸水中煮制牛肉的时间分别为5、10、15、20、25、30 min。分别取出水煮样品，并过滤肉汤，得到汤渣，将水煮牛肉样品和汤渣冷冻干燥、研磨脱脂，待测。每个处理设置3 次重复。

2)烤制试验。取100 g 牛肉样品，切成3 cm×4 cm×(1 ～1. 5) cm 的肉块，于烤箱中架空烘烤，底层用瓷盘接滴落烤渣。依据预试验中牛肉180℃烘烤至熟需要30 min，设定180℃条件下烤制5、10、15、20、25、30 min，分别取烤制牛肉样品和烤渣，随后进行冷冻干燥、研磨脱脂等处理，待测。每个处理设置3 次重复。

3)油炸试验。取100 g 牛肉样品，切成2 cm×3 cm×(1～1.5) cm 的肉块，置于油锅中，依据预试验结果，设定150℃油炸1、2、3、4、5 min，分别取油炸牛肉和炸油样品，油炸牛肉进行冷冻干燥、研磨脱脂等处理，待测。每个处理设置3 次重复。

1.3.3 稳定碳、氮同位素比率检测方法 称取2 mg样品包裹成球状放入锡杯(2 mm×3 mm×5 mm)中。采用元素分析仪与同位素比率质谱仪联用分析稳定碳、氮同位素比率。样品先经元素分析仪燃烧管(850℃)燃烧生成CO2和NOX，通过He 以230 mL·min-1的流速转移至还原管(650℃)，再经过稀释仪，最后进入质谱仪进行检测。具体工作参数如下:

稀释仪参数设置:He 稀释压力为4 bar，CO2参考气压力为4 bar，N2参考气压力为4 bar。

稳定碳、氮同位素比率分别用δ13C‰和δ15N‰表示，δ13C 的国际相对标准为V-PDB，δ15N 的国际相对标准为空气。按照公式进行计算:

式中，δ 表示δ13C 和δ15N；R 分别是13C/12C 或15N/14N。

参考气体CO2和N2根据国际参考标准，以国际原子能机构(international atomic energy agency，IAEA)提供的IAEA-600 咖啡因(δ13CPDB＝-27.77‰±0.043‰)和USGS24(δ13CPDB ＝-16.04‰±0.035‰)校准碳，IAEA-N-1(δ15Nair＝0.4‰±0.2‰)和IAEA-600 咖啡因(δ15Nair＝1.00‰±0.2‰)校准氮。δ13C 和δ15N 的检测精度为0.2‰。

1.4 数据处理

利用SPSS 22.0 软件对数据进行单因素方差分析和Duncan’s 多重比较。试验数据均表示为平均值±标准偏差。

2 结果与分析

2.1 不同加工时间对牛肉稳定碳同位素的影响

2.1.1 水煮时间对稳定碳同位素的影响 由表1可知，吉林和内蒙未加工脱脂牛肉的δ13C 值分别为-10.5‰ 和-23.7‰。这主要是由于牛所食饲料不同导致存在差异，吉林牛主要是以玉米为主的谷物饲料喂养[30]，内蒙牛主要以C3牧草为饲料喂养[30]。两组样品脱脂牛肉随着水煮时间的延长(5～30 min)其δ13C 值与对照组δ13C 差值均小于0.1‰，不同水煮时间的脱脂牛肉与对照组无显著差异。两组样品未加工牛肉粗脂肪δ13C 值分别为-14.4‰和-28.7‰，水煮时间由5 min 增加至30 min 时，粗脂肪中δ13C 值无显著变化，且与对照组牛肉粗脂肪无显著差异。水煮5 ～30 min 得到的副产物脱脂汤渣δ13C 值均低于相应对照组牛肉，均值差异小于0.5‰，但水煮后的脱脂汤渣与对照组δ13C 值之间无显著差异。

表1 不同水煮时间对δ13C 值的影响Table1 The effect of different boiling time on δ13C value /‰

2.1.2 烤制时间对稳定碳同位素的影响 由表2可知，吉林和内蒙两产地牛肉样品不同烤制时间(5 ～30 min)的脱脂牛肉δ13C 值分别-10.5‰和-23.8‰～-23.7‰，与对照组δ13C 值均无显著差异。吉林和内蒙的牛肉粗脂肪在不同烤制时间δ13C 值变化较小，其范围分别介于-14.3‰～-14.2‰和-29.2‰～-28.9‰之间，不同烤制时间牛肉粗脂肪中的δ13C 值也均无显著差异。

2.1.3 油炸时间对稳定碳同位素的影响 由表3可知，经1～5 min 油炸，两组样品脱脂牛肉与对照组脱脂牛肉δ13C 值无显著差异。吉林牛肉样品油炸1～5 min粗脂肪δ13C 值介于-25.8‰～-25.4‰之间，不同油炸时间处理组间无显著差异，但显著低于对照组(-14.4‰)。内蒙牛肉对照组粗脂肪δ13C 值为-28.7‰，油炸1～5 min δ13C 值介于-29.1‰～-28.9‰之间，不同油炸时间处理组样品无显著差异。这主要受油炸所用植物油影响。植物油δ13C 值为-29.7‰，油炸牛肉脱脂后所得到的粗脂肪中含该植物油，因此粗脂肪中δ13C 值与植物油δ13C 值接近。此外，不同时间的炸油δ13C 值无显著差异，说明高温对炸油δ13C 值无显著影响。

表2 不同烤制时间对δ13C 值的影响Table2 The effect of different roasting time on δ13C value /‰

2.2 不同加工时间对牛肉稳定氮同位素的影响

2.2.1 水煮时间对稳定氮同位素的影响 由表4可知，对照组吉林和内蒙脱脂牛肉的δ15N 值分别为2.6‰和6.7‰，这可能是由于喂养饲料不同导致存在差异。同时，两组样品的δ15N 值在水煮5 ～20 min 内无显著变化，水煮25 min 和30 min 时吉林脱脂牛肉δ15N 值显著高于对照组，差值为0.3‰；水煮25 min时，蒙脱脂牛肉δ15N 值与对照组存在显著差异，δ15N值相差0.9‰。水煮25 min 和30 min 时吉林牛肉汤渣中δ15N 值同样与对照组显著差异，水煮25 min 时内蒙牛肉汤渣中δ15N 值与对照组存在显著差异，其差值为-0.5‰。两组牛肉水煮后δ15N 值均高于对照组，两组汤渣中δ15N 值均低于对照组，说明氮同位素经水煮后存在一定的分馏效应。

表4 不同水煮时间对δ15N 值的影响Table4 The effect of different boiling time on δ15N value /‰

2.2.2 烤制时间对稳定氮同位素的影响 由表5可知，经1～5 min 的烤制，吉林和内蒙脱脂牛肉δ15N 值分别介于2.5‰～2.6‰和6.8‰～7.0‰之间，δ15N 差值小于0.2‰，不同烤制时间处理组间无显著差异，且与对照组脱脂牛肉δ15N 值无显著差异。

表5 不同烤制时间对δ15N 值的影响Table5 The effect of different roasting time on δ15N value /‰

2.2.3 油炸时间对稳定氮同位素的影响 由表6可知，经1～5 min 的油炸，吉林和内蒙脱脂牛肉δ15N 平均值分别为2.8‰和6.9‰，不同油炸时间δ15N 差值均小于0.3‰，且与对照组脱脂牛肉均无显著差异。

表6 不同油炸时间对δ15N 值的影响Table6 The effect of different frying time on δ15N value /‰

3 讨论

本研究探讨了牛肉不同组织及加工副产物稳定碳、氮同位素比率经不同加工方式的变化，进一步确证其在加工过程中的稳定性。脱脂牛肉的δ13C 和δ15N值经不同时间的水煮、烤制和油炸后差值较小(＜0.5‰)，即水煮、烤制和油炸3 种加工方式对牛肉稳定碳、氮同位素无显著影响。这与Doering[31]的研究结果一致，烤制对鲑鱼肌肉组织中的稳定碳、氮同位素无显著影响；另有研究也表明，鲭鱼和黑线鳕鱼在煮、烤、蒸等不同加工条件下，其稳定碳和氮同位素分馏值＜1‰[27]。前人研究也发现，面条、面包和饼干等面制品加工过程中原料和成品之间稳定碳、氮同位素也基本无显著差异[14，32]，且谷物在230℃高温不同加热时间对δ13C 和δ15N 值的影响也比较小，虽然稳定氮同位素随着加热时间的延长呈逐渐升高的趋势，但仅增加1‰[33]。本研究发现，随着水煮时间的延长脱脂牛肉中δ15N 也呈升高趋势，脱脂汤渣中δ15N 值呈降低趋势，水煮25 min 和30 min 时脱脂牛肉δ15N 值高于对照组牛肉，但二者差值仅为0.3‰。与不同产地牛肉稳定氮同位素差异相比，加工对稳定氮同位素组成影响较小，即加工导致的分馏效应不足以影响鉴别不同地域的牛肉产品。

肉制品中的不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸等在热加工过程中均可能发生变化[34]。牛肉在烹饪过程中硬脂酸和总饱和脂肪酸的含量均有所增加，但总不饱和脂肪酸含量降低[35]，蒸煮牛肉时其多不饱和脂肪酸增加而饱和脂肪酸含量保持不变[36]。虽然烹饪过程中脂质组成发生不同的变化，但本研究发现，水煮和烤制牛肉粗脂肪中的稳定碳同位素经不同时间加工后与对照组均无显著差异，因此牛肉粗脂肪中的稳定碳同位素不受水煮和烤制加工的影响。油炸1～5 min 内测定的粗脂肪δ13C 值无显著差异，但与所用植物油中δ13C值非常相近，这主要是由于油炸牛肉脱脂后收集的粗脂肪为油炸所用植物油和牛肉所含粗脂肪的混合物，因此油炸后粗脂肪的δ13C 值不受加工时间的影响，但受加工介质的影响[30]。本研究主要分析了3 种加工方式单独对稳定碳、氮同位素的影响，后续可以进一步探讨牛肉连续不同方式加工后其稳定同位素的分馏效应及机制。

4 结论

本研究结果表明，吉林和内蒙两地饲喂方式不同的牛肉经不同加工方式处理不同时间后，脱脂牛肉中稳定碳、氮同位素分馏均较小，其中稳定氮同位素经25 min 水煮后与对照组有显著差异，差值仅为0.3‰，但与不同产地牛肉稳定氮同位素差异比较，加工导致的分馏效应不足以影响鉴别不同地域的牛肉产品。可见，加工方式及加工时间对牛肉中稳定碳、氮同位素基本无显著影响，稳定碳、氮同位素可直接用于牛肉加工半成品和成品的原产地溯源。