云南巍山地区广义虫草的物种多样性研究

赵志远, 王元兵, 王志勤, 汤德相, 耿宇鹏, 虞泓*

(1. 云南大学生态与环境学院, 昆明 650091; 2. 云南大学-中国(云南)东南亚虫草生物资源可持续利用国际联合研究中心, 昆明 650091)

广义虫草(Cordycepssensu lato)，是肉座菌目(Hypocreales)真菌寄生在无脊椎动物、少数真菌和黏菌等的总称。虫草是重要的药用和生物防治资源，对保健产品开发和农林有害昆虫调节有重要作用。冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)、蛹虫草(Cordyceps militaris)和蝉花虫草(C. cicadae)等含有多种生物活性成分，如虫草酸、多糖、腺苷等，对抗氧化、抗肿瘤、润肺、提高免疫力和降血糖血脂有明显功效，具有重要的药用价值[1]。在生物防治研究中，球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、布氏白僵菌(B. brongniartii)等白僵菌属物种对生态系统节肢动物种群调节和稳定有重要作用[2]。自然界中虫草种类繁多，我国更是具有丰富和独特的虫草资源，据不完全统计，全球已报道的虫草种类约有100属800余种，其中我国约有40多属400余种[3]。作为世界上12个生物多样性丰富的国家之一，虫草资源的调查对丰富我国真菌多样性具有重要意义[4]。前期，宋斌等[5]对滇黔桂虫草资源多样性进行了初步调查，发现52种虫草，表明中国是虫草的一个分布中心。唐保宏等[6]整理报道了河南省的10种虫草资源，并提出开发和保护建议。彭凡等[7]报道安徽万佛山地区6种虫草资源，其中1种为中国新记录。虫草的分布与地理位置、气候和植被类型等环境因素有很大关系，因此对不同地区虫草进行物种多样性研究，可以更好地了解不同生态系统中虫草物种分布格局。目前，有关虫草的开发应用正在深入展开，对虫草资源进行广布性调查，明确各地区虫草物种名录，可以为保护与合理开发利用虫草资源提供基础信息，为有害昆虫生物防治提供理论依据。

大理白族自治州位于云南省中西部，平均海拔2 090 m，主要以山地为主，地势西北高、东南低。全年温差较小，四季如春，年均降雨量约1 053 mm，四季干湿分明[8]。巍山彝族回族自治县位于大理白族自治州的西南部，地处哀牢山和无量山的北部,是澜沧江和红河两大水系的分水岭，并且具有纵贯巍山坝子的西河为国际河流——红河的源头。巍山地区属亚热带季风气候类型，年均温为15.7℃, 降雨量约812.6 mm[9-10]。因其独特的地形地貌、全年温和的气候条件以及茂密的天然森林植被，为该地区真菌资源的形成提供了良好的地理优势和生态环境，因此巍山地区势必拥有丰富的虫草物种多样性。

本研究于2019年7-9月分别在巍山地区东、西、南、北和中部设置样地进行虫草的资源调查,通过形态观察及多基因系统发育分析鉴定物种,采用α多样性和物种相对频率分析探讨该地区虫草物种多样性，基于物种累计曲线预测巍山地区虫草丰富度，以期了解该地区虫草物种多样性和分布特点, 为虫草资源的保护和可持续利用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验区概况

巍山彝族回族自治县位于云南省西部，地处99°55′~100°25′ E，24°56′~25°32′ N。全县面积2 183.01 km2，山地面积占全县的94%，具有丰富的森林植被资源。巍山地区森林多为天然林，以针叶林和针阔混交林为主，多为云南松(Pinus yunnanensis)和栎树(Quercus linn)、冬瓜树(Alnus cremastogyne)、核桃(Juglans regia)、高山榕(Ficus altissima)和华山松(Pinus armandii)组成[11]。

1.2 方法

标本采集2019年7-9月分别在巍山地区东、西、南、北和中部的巍宝山、紫金山、小鸡足山、红河源和卫东林场采集虫草标本。虫草通常生长在林中灌木丛下、枯枝落叶层或树叶背面等环境湿度较高的地方，采用沿路踏查、普查等方式，在适宜虫草生长的小生境下采集。采集的标本用脱脂棉包好，放入灭菌的收集管和密封袋保鲜，于4℃冰箱内保存。

菌株分离参见梁宗琦等[12]和王元兵等[13]的方法，采取子囊孢子分离法、组织分离法和表面消毒法进行菌种分离。所有虫草标本均保存在云百草标本馆(YHH)，纯化分离菌株均保存于云南真菌培养物保存中心(YFCC)。

物种培养和鉴定使用PDA培养基在25℃下培养虫草，采取形态观察和多基因(nrSSU、nrLSU、EF-1α、RPB1和RPB2)系统发育分析的方法[14-15],鉴定采集物种。形态观察包括寄主的种类、有性型和无性型等特征。采用CTAB法提取成熟菌丝的总DNA对5个基因片段进行PCR扩增后，用1%琼脂糖胶进行电泳检测，将条带明亮且无杂带的样品送至铂尚生物技术(上海)有限公司进行测序。根据已有研究[16-20]，在GenBank数据库中检索并下载虫草的5个基因序列，对单个基因数据矩阵序列进行比对，N表示缺失的片段，最后将5个基因数据矩阵序列进行拼接整合，以Trichoderma deliquescens和T. deliquescens作为外类群，用RAxML软件进行多基因系统发育分析, 构建系统发育树(最大似然树),确定各物种的分类地位，最后选取每种物种的代表性菌株显示在系统发育树上。

物种多样性分析基于α多样性分析研究样地内虫草真菌数量特征，物种丰富度指数、多样性指数、均匀度指数和优势度指数，用RStudio的Vegan软件包进行统计分析[21-23]。相对频率(relative frequency, RF)指巍山地区采集的某种虫草物种数占该地区虫草总数的百分比。相似性系数(similarity coefficient, Cs)采用Sorenson公式计算：Cs=2j/(a+b)，式中，j指两样地间共有的虫草物种数，a指一个样地的虫草物种数，b指另一样地的虫草物种数目[24]。利用EstimateS软件计算和分析ACE指数和Bootstrap指数，以获得物种期望丰富度(S)。通过Excel绘制巍山地区虫草的物种累计曲线(species accumulation curve)。

2 结果和分析

2.1 虫草物种鉴定

本次调查共采集虫草341株，初步鉴定巍山地区有20种虫草，隶属于2科5属，分别是虫草科(Cordycipitaceae)的虫草属(Cordyceps)、白僵菌属、Samsoniella和线虫草科(Ophiocordycipitaceae)的线虫草属(Ophiocordyceps)和多头霉属(Polycephalomyces)。其中有7种为疑似新物种，隶属于2科4属, 其中，2种虫草属、2种Samsoniella、1种多头霉属和2种线虫草属(表1, 图1)。

表1 巍山地区调查样地信息Table 1 Investigate plots in Weishan County

2.2 虫草分布特征

巍山地区采集到341株虫草，分别鉴定为13种已知种和7种疑似新物种，其中巍宝山9种(73株)，占该地区总数的21.4%；紫金山8种(53株), 占15.5%；小鸡足山9种(25株)，占7.3%；红河源13种(125株)，占36.7%；卫东林场8种(61株)，占17.9%。只有细脚虫草(C. tenuipes)和球孢白僵菌在5个样地均有分布。基于物种丰富度指数、Berger-Parker 优势度、Shannon-Wiener多样性指数、Pielou均匀度指数分析巍山地区东、西、南、北和中部5个样地的虫草物种多样性表明，该地区虫草物种多样性较高，优势种属现象较为明显，优势属为虫草属(优势度为0.63，共采集215株)，优势种为蛹虫草(生态优势度为0.27，共采集了93株)，虫草寄主涉及鳞翅目、鞘翅目、膜翅目和半翅目昆虫，主要是鳞翅目。对各样地虫草物种多样性的分析表明,北部的红河源样地虫草物种多样性较高(Shannonwiener指数为1.76，物种丰富度为13种)，多样性最低的是南部的小鸡足山(Shannon-wiener指数为1.60，物种丰富度为9种)。

用物种相似性系数(Cs)来比较巍山地区不同样地间的虫草物种组成的相似度。从表3可见，巍山地区5个样地中，红河源样地与其他样地的相似度最高，为0.38~0.64；巍宝山样地与红河源样地的物种相似度最高，Cs达0.64；小鸡足山与紫金山样地、巍宝山与卫东林场样地的虫草物种组成最为接近, Cs为0.58；而小鸡足山与卫东林场样地的Cs最低，为0.24。

2.3 虫草物种累计曲线

物种累计曲线是描述随抽样数量增多而增加物种数量的模型，是调查研究样地物种组成和预测物种丰度的理想工具[25]。本研究基于巍山东、西、南、北和中部5个研究样地虫草的物种分布数据，利用EstimateS软件计算和分析了巍山地区虫草多样性,绘制了巍山虫草物种累计曲线。

根据物种累计曲线图和EstimateS软件计算,ACE值和Bootstrap值分别为21.16和22.72，表明该地区虫草丰富度约为21~23种，估计本次研究已经调查了巍山地区86.96%~95.24%的虫草。

3 结论和讨论

图1 基于5个基因(nrSSU、 nrLSU、EF-1α、RPB1和RPB2)构建的巍山地区虫草系统发育树。*: 采自巍山地区。Fig. 1 Phylogenetic tree of Cordyceps sensu lato from the Weishan country constructed by the analysis of five-locus (nrSSU, nrLSU, EF-1α, RPB1 and RPB2)dataset. *: Collected from Weishan area.

表2 虫草标本统计Table 2 Statistics of Cordyceps sensu lato specimens

表3 巍山地区的虫草物种多样性指数Table 3 Diversity indexes of Cordyceps sensu lato in Weishan County

图2 巍山地区的虫草物种累计曲线Fig. 2 Species accumulation curve of Cordyceps sensu lato in Weishan County

本研究结果表明，巍山地区拥有丰富且独特的虫草资源，其虫草物种多样性较高，物种丰富度较大。本次调查的采样范围涉及巍山地区的东、南、西、北和中部5个样地，包括未被人类活动干扰的样地以及已被开发的自然保护区样地，以期更详细探明巍山地区虫草的数量及种类。本次调查共采集虫草341株，鉴定出20种虫草，其中有7种疑似新物种，分别隶属于虫草科的虫草属、Samsoniella以及线虫草科的多头霉属和线虫草属。

本次研究表明，巍山地区北部红河源样地具有较高的虫草物种多样性，南部的小鸡足山的虫草物种多样性较低，推测可能与巍山地势北高南低且海拔悬殊较大，中部被山脉阻隔划分为不同水系导致南北部森林植被不同有关。此外，物种多样性最高的红河源样地森林植被覆盖良好且物种丰富，山间流淌溪流，空气湿度大且昆虫种类丰富，因而造就了该地区独特和丰富的虫草多样性。小鸡足山山间种植许多的经济作物且山顶有祭祀等活动，人类干扰较大，空气湿度相对较低，昆虫种类及丰度不大,因而该地区的虫草物种多样性相对较低。因此虫草更适宜生活在人为干扰较低、气候条件优越、且生物多样性较高的自然生态系统内[26]。

表4 巍山样地间的虫草物种相似性系数Table 4 Similarity coefficient (Cs) of Cordyceps sensu lato among plots in Weishan County

巍山地区虫草资源优势种属现象明显，优势属为虫草属，优势种为蛹虫草，占菌株总数的27%。蛹虫草为世界广布种，分布于热带、亚热带和温带地区，具有较宽的生态位，对森林生态系统的昆虫群落数量的稳定具有重要作用。此外，蛹虫草药食同源，具有卓越的医药用途和保健价值，含有多种活性成分，其在免疫调节、抑菌、抗肿瘤和抗病毒上具有重要的药理作用，广泛应用于医药、食品和保健品中。前期研究表明，蛹虫草发生与生态环境因子的综合作用有密切关系，主要影响因子包括温湿度、植被类型、寄主昆虫以及土壤质地等[27]，不同生境下蛹虫草变异式样差异较大，主要包括子座大小与子囊大小以及着生方式上的区别[28-29]。本次调查不同生境样地中，红河源样地的蛹虫草丰富度最高，但形态比其他样地较小，子座相对较短, 可能是该样地虫草物种多样性较高，寄主鳞翅目蛹昆虫在较小时便被感染，其营养物质不足以长出粗长的子座，导致该地区蛹虫草形态较小，但丰富度很高。

巍山地区北部红河源样地与东部巍宝山样地的虫草物种相似度最高，相似系数为0.64，表明两样地的虫草物种最为相似；南部小鸡足山与中部卫东林场样地物种相似系数为0.24，表明两地的物种相似度最低。可能地理隔离的因素更能决定虫草的分布和物种组成的相似性，可以为日后对野外虫草调查提供参考。

巍山地区的虫草资源调查丰富了大理州乃至云南省的虫草物种资源库，同时为云南省及国内其他地区的虫草资源调查奠定了一定基础[30]。本次调查基本弄清该地区的虫草物种种类，对当地的虫草资源保护和可持续利用提供了理论依据。由于本次调查研究的取样范围以及采集到的虫草标本有限，调查到的虫草资源物种主要涉及虫草科和线虫草科物种，对于未调查到的麦角菌科物种在日后对于滇中西部地区的真菌资源调查研究中尚需加强关注。