大口黑鲈北方亚种、佛罗里达亚种及“优鲈3号”杂交F1子代生长性能及遗传多样性分析

王佩佩，周国勤，陈树桥，陆 健

（南京市水产科学研究所，南京 210036）

大口黑鲈（Micropterussalmoides）又名加州鲈，属于鲈形目（Perciformes），太阳鱼科（Centrarchide），黑鲈属，原产于北美地区，属广温性鱼类，在水温2～34℃、盐度0～15时均可存活，其肉质鲜嫩、营养丰富、抗病力强、生长迅速，有“淡水黄鱼”的美称，已被引进到世界其他各地作为游钓品种或水产养殖品种［1］。20世纪70年代末我国台湾省从国外引进大口黑鲈，并于1983年人工繁殖获得成功，同年从台湾省引入广东省进行人工养殖。大口黑鲈养殖近40年来，产业规模不断扩大，深受养殖者和消费者的欢迎，已成为我国重要淡水养殖品种之一，现阶段大口黑鲈养殖年产量超过45万t［2］，且每年以一定的规模扩增。然而，大口黑鲈自引种以来再未有新的种质资源应用于实际生产养殖，在经过PAPD、AFLP、微卫星［3－5］等方法对国内养殖的大口黑鲈群体进行分析后发现，遗传多样性已经显著降低，优良性状发生退化［6－7］。因此，亟需选育出兼具生长性能好、抗逆性强的大口黑鲈新品种系。

微卫星DNA（microsatellite DNA）是一种在真核生物基因组中广泛分布的短串联重复DNA序列，是动植物遗传及育种研究较常用的一种分子标记，微卫星具有种类多、分布广、多态信息含量高、操作容易、易于扩增等优点［8－9］，已在水产动物辅助育种、种质资源鉴定、遗传结构分析等方面广泛应用。杂交育种能够将亲本的优良性状转移给子代，是获得具有优良经济性状养殖品种的有效途径之一。

最初引种进入国内的大口黑鲈品种为北方亚种，后又引入佛罗里达亚种，北方亚种具有生长快的特点，佛罗里达亚种耐高温、抗病力强，而大口黑鲈新品种“优鲈3号”为人工培育的能摄食配合饲料的新品种，可利用这3个种系的优点培养具有杂交优势的新品系。本研究利用“优鲈3号”、佛罗里达亚种及北方亚种作为亲本来源进行选育，对杂交子代同塘养殖生长性状进行统计分析，同时结合微卫星标记技术分析群体间的遗传多样性来筛选优良组合，以期为大口黑鲈优良品种的培育提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用亲鱼来源于中国水产科学研究院珠江水产研究所良种基地自繁自育的“优鲈3号”、佛罗里达亚种及北方亚种，选取其中体质健壮、个体大、体色好、无损伤、无病害的个体［体质量（598±104.45）g］作为繁育亲本。

1.2 实验方法

1.2.1 人工繁育

2018年4月初，对“优鲈3号”、佛罗里达亚种及北方亚种3个种群在相同时间内进行人工繁育，共设计3种杂交组合方式，分别为“优鲈3号”♀（T）×北方亚种♂（N）、“优鲈3号”♀（T）×佛罗里达亚种♂（S）、佛罗里达亚种♀（S）×北方亚种♂（N），3种杂交群体分别用TN、TS、SN表示，每种杂交组合选取亲鱼100尾（雌雄各50尾）1∶1进行配对，待亲鱼性腺发育逐步成熟后用地欧酮和HCG进行激素注射，使之能够同步产卵。雌鱼用量为地欧酮5 mg·kg－1，HCG 1 000单位·kg－1，两者混合制成注射液进行注射，雄鱼注射量减半。产卵孵化后，对鱼苗进行常规培育。培育过程中保持各组鱼苗的生活环境基本相同。

1.2.2 生长对比

为比较各杂交组合子代在外部生长环境相同情况下生长上的优劣，在鱼苗生长达到3.5月龄后用1mm金属丝（CWT）对尾部、背部及胸部进行标记，各组合的标记部位如表1所示，每种杂交组合子代个体各标记1 000尾，标记后在同一池塘中进行同塘养殖，饵料来源为粗蛋白含量48%的膨化饲料，每隔一段时间从池塘中随机取样，每个群体取120尾（雌雄各60尾），对其体质量（精确到0.01 g）进行测量。

表1 不同杂交组合金属丝标记部位Tab.1 CWT marker sites of different hybrid combinations

1.2.3 DNA提取

从每个组合子代中剪取32个个体的尾鳍样本，采用上海捷瑞生物工程有限公司的细胞／组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）进行DNA提取，提取的基因组DNA采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测质量和浓度，剔除未提取出来或浓度较低的DNA并重新提取，留取可用DNA样品保存于－20℃备用。

1.2.4 微卫星引物筛选及PCR扩增

从已开发的大口黑鲈微卫星引物中挑选出9个能稳定扩增的位点用于群体分析［10］。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物位点详细信息见表2。PCR扩增反应体系（20μL）：灭菌水（7.4μL）、2×TaqMix（10μL）、10μmol·L－1正反引物（各0.8μL）、模板DNA（1μL）。PCR荧光扩增反应体系（10μL）：灭菌水（5.79μL）、2×TaqMix（2.85μL）、10μmol·L－1正引物（0.04 μL）、10μmol·L－1反引物和荧光引物（各0.16 μL），50 ng·μL－1模板DNA（1μL）。PCR反应程序：94℃预变性5 min，32个循环，其中每个循环包括94℃变性30 s，退火温度30 s（各个位点退火温度详见表2），72℃延伸30 s，最后72℃延伸5 min，4℃保存。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在凝胶成像仪中观察是否扩增出目的片段且成单一条带，若有单一条带，则上样于ABI 3500 xl基因分析仪进行毛细管电泳，检测荧光信号并利用软件GeneMarker 1.97分析微卫星位点的片段长度。

1.3 数据统计与分析

运用Popgene32（Version 1.31）分析各个群体在9个微卫星位点的等位基因数（A）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、Nei氏遗传距离（Ds）、遗传相似度、遗传分化指数（Fst）和基因流（Nm）；用PIC CALC软件计算多态信息含量（PIC）。根据群体间的Nei氏遗传距离，用Mega 5.0软件进行UPGMA聚类分析，以分析杂交群体之间的亲缘关系。体标数据采用SPSS 17.0进行分析，在单因子方差分析的基础上采用Duncan’s多重比较检验组间差异，以P＜0.05作为差异显著。

大口黑鲈F1子代绝对增长率（AGR）、相对增长率（RGR）的计算公式如下：

绝对增长率：AGR＝（W2－W1）／（t2－t1）

相对增长率：RGR＝（W2－W1）／W1（t2－t1）

式中，W1和W2分别表示幼鱼在不同月龄的体质量（g），t1和t2分别表示两个不同的月龄。

2 结果与分析

2.1 体质量分析

分别对大口黑鲈3个杂交组合F1子代在2月龄、3.5月龄、5月龄、6月龄和7月龄共5个月龄的体质量进行分析。数据显示，3个组合子代的平均体质量在不同月龄呈现不同程度的显著性差异（P＜0.05）（表3），根据平均数可知，TS组合在5个月龄的平均体质量均高于其他两个组合，其次为TN。

2.2 绝对增长率和相对增长率

在绝对增长率方面，TS组合在2～3.5月龄、3.5～5月龄、5～6月龄、2～7月龄4个月龄段显著高于其他两个组合（P＜0.05），其次为TN。各组合的相对增长率在各月龄没有显著差异（P＞0.05）（表4）。

2.3 微卫星分析

TN、TS、SN 3个群体的遗传参数信息见表5（包括各个位点在3个群体中的等位基因数、观测杂合度、期望杂合度和多态信息含量）。3个群体的平均多态信息含量分别为0.511、0.521、0.382 3，其中TS群体的多态信息含量最高；观测杂合度分别为0.604 2、0.559 0、0.472 2；期望杂合度分别为0.573 4、0.600 3、0.454 2。各基因座的基因流（表6）平均为2.470 9（1＜基因流＜4），遗传分化指数平均值为0.091 9，存在一定程度的遗传分化，其中JZL12位点的遗传分化较大（基因流＜1），JZL85、JZL23、JZL31 3个位点的遗传分化较小（基因流＞4）。用Popgene32计算3个群体的Nei氏遗传距离与遗传相似度（表7），数据显示，TS群体和TN群体的遗传相似度最高（0.912 6），TN群体和SN群体的遗传相似度最低（0.776 1）。聚类分析显示TS群体和TN群体先聚为一支，再与SN群体聚为一支。

表2 大口黑鲈9对微卫星引物序列及特征Tab.2 Primer sequences and characteristics of ninem icrosatellites of M icropterus salmoides

表3 不同生长时期体质量的平均值及多重比较Tab.3 Average value and multiple comparisons of body weight at different grow th stages （g）

表4 3种组合的绝对增长率和相对增长率Tab.4 Absolute and relative grow th rates of three combinations

表5 9个微卫星位点在3个群体中的遗传参数Tab.5 Genetic parameters of ninem icrosatellite loci in three populations

表6 3个群体在9个微卫星位点上的遗传分化系数（F st）与基因流（N m）Tab.6 Genetic differentiation coefficient（F st）and gene flow（N m）at ninem icrosatellite loci in three populations

表7 大口黑鲈3个杂交组合Nei氏遗传距离与遗传相似度Tab.7 Genetic distance and genetic sim ilarity of Nei in three hybrid com binations of M icropterus salmoides

图1 3个群体聚类分析Fig.1 Cluster analysis of three populations

3 讨论

杂交育种是指不同品种、品系间以及不同种属间、亚科间的个体通过杂交，获得在生长性能及遗传多样性等方面优于双亲的新品种［11］，通过杂交可以有效地增加群体遗传结构变异和遗传分化，提高群体的遗传多样性，也可以将双亲的优良性状最大程度地集中到后代中［12］，从而改善后代的生长性状，获得人们预期的优良新品种（系），因此杂交育种已经成为改善鱼种品质的重要手段之一［13］。微卫星DNA用于群体标记时主要检测指标有等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、PIC值等、遗传分化指数等，一个群体的等位基因数越大，PIC值就越大：当PIC＞0.5时，该基因位点为高度多态位点；0.25＜PIC＜0.5时，为中度多态位点；PIC＜0.25时，为低度多态位点［14］。控制不同性状的基因座位越丰富，该群体的遗传多样性就越高，所含优良性状的概率更大，对环境变化所产生的适应能力就越强，更适合作为选育的基础群体，本研究将“优鲈3号”、佛罗里达亚种、北方亚种3个群体的大口黑鲈作为基础群体，培育出3个杂交子代群体，采用9对微卫星引物对3个子代群体进行检测，发现TS组合的平均等位基因数、平均PIC值、平均期望杂合度等都高于其他两个组合，且PIC值为0.521，表现为高度多态（PIC＞0.5），这表明TS组合具有更大的选育空间和开发潜力。遗传杂合度的大小直接反映了群体遗传变异的高低［15］，杂合度越高，遗传变异越高，群体适应环境的能力越强，本研究中3个群体的平均观测杂合度和期望杂合度都相对较高，说明3个群体的遗传多样性都相对较高，可以用作选育的基础群体。3个群体在9个微卫星位点的遗传分化系数为0.091 9，表示有9.19%的遗传分化来自于3个不同的组合之间，说明这3个组合有一定程度的遗传分化，具有潜在的选育潜能。现有的大口黑鲈引进原种主要分为两个亚种，一种是分布在美国中东部、墨西哥东北部和加拿大东南部的大口黑鲈北方亚种［16］，另一种是分布在佛罗里达州南部的大口黑鲈佛罗里达亚种［17］。2010年，大口黑鲈“优鲈1号”（简称“优鲈1号”）通过国家水产新品种审定，成为世界上第一个大口黑鲈选育新品种［18］。大口黑鲈最新品种“优鲈3号”是以之前通过审定的新品种“优鲈1号”和从美国新引进的大口黑鲈北方亚种为基础选育种群，采用群体选育技术与分子生物学技术相结合的育种方法，以摄食人工配合饲料条件下的生长性状和易驯化摄食配合饲料为主要选育指标，经连续4代选育而获得，其相对于普通大口黑鲈生长优势更加明显［19］，本研究中，将“优鲈3号”群体分别和佛罗里达亚种、北方亚种进行杂交，结果显示“优鲈3号”♀（T）×佛罗里达亚种♂（S）（TS）在生长性能方面更优于“优鲈3号”♀（T）×北方亚种♂（N）（TN），3个群体生长性能大小依次是TS＞TN＞SN。在对我国引进大口黑鲈分类地位研究中，中国水产科学研究院珠江水产研究所采用两对微卫星引物分别对原产地北方亚种、原产地佛罗里达亚种、我国养殖的大口黑鲈群体进行微卫星对比，发现我国养殖的大口黑鲈属于北方亚种［20］，由此可知“优鲈3号”也属于经过选育的北方亚种，在本研究中，“优鲈3号”♀（T）×佛罗里达亚种♂（S）（TS）生长性能优于“优鲈3号”♀（T）×北方亚种♂（N）（TN）和佛罗里达亚种♀（S）×北方亚种♂（N）（SN），体现出了亚种间的杂交优势，说明对具有不同优势的亚种进行杂交是提高大口黑鲈生产性能及遗传多样性的一个有效途径，能更进一步提升杂交后代的品质。综上所述，在本研究中，“优鲈3号”♀（T）×佛罗里达亚种♂（S）（TS）杂交组合，在一定程度上提升了杂交后代的遗传多样性和生长性能，其杂交组合更优。本研究结果可为大口黑鲈进一步的品种培育和遗传改良提供科学依据，为大口黑鲈的产业发展提供一定的良种支撑。