利用SCoT引物鉴别15个甜菜品种

邳植，吴则东，黄林玉

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080）

0 引言

糖用甜菜（Beta vulgaris L.）属于石竹目（Caryophyllales）、苋科（Amaranthaceae）、甜菜亚科（Betoideae）、普通甜菜属（Beta）[1]。栽培甜菜是两年生异花授粉的草本植物，在第一年进行营养生长，长出膨大的根，经过春化后，在第二年进行生殖生长[2]。糖用甜菜是世界上重要的两种制糖原料之一，甜菜所生产的食糖约占世界食糖总量的20%，其中美国和欧盟是全球甜菜糖的领导者[3]。糖甜菜也是我国北方重要的经济作物，2017年内蒙古和新疆甜菜种植面积为12.77万hm2[4]。

自2000年以来，从国外引进品种几乎占据了中国甜菜种子的全部市场，目前，国外甜菜品种已经占到中国甜菜种子市场的95%以上，其中从德国、比利时、意大利和法国引进的甜菜种子数量占98%以上[5]。甜菜种子多采用包衣或丸粒化处理，由于甜菜的遗传基础较窄[6-7]，从传统外形上的差异来辨别甜菜品种很难，不同的国外跨国种子公司会在甜菜丸粒化加工时加入不同的警戒色，但要实现甜菜品种真实性的鉴别，使用最多的仍然是形态学的DUS 测试。目前“NY/T 2482-2013 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南糖用甜菜”的国家标准已经颁布，虽然甜菜新品种登记必须要进行DUS 测试，但是由于甜菜本身遗传基础比较狭窄，品种间使用同一父本或同一母本的现象比较普遍，而形态学鉴定的方法不仅受环境的影响比较大，也受到具体测试人员的影响，而且检测的周期非常长，一般需要整个生长周期。分子标记技术具有任何时间均可取样的特点，而且不受环境的影响。目前已经有多种分子标记技术应用于甜菜等作物的品种鉴定，例如SRAP[8]、CDDP[9]、ISSR[10-13]、RAPD[11-12]、AFLP[11]、DAMD[12]、SSR[13-14]及SNP 分子标记[15]等，这些标记表现出基因之间的实际遗传变异水平，其构建得到的指纹图谱能更加直接、准确区分出不同品种的差异。

在本研究中，拟选择的起始密码子多态性（Start codon targeted polymophism，SCoT）分子标记进行甜菜指纹图谱构建，该标记是2009 年由Collard 等人提出的一种基于单引物扩增反应的目的基因分子标记方法[16]。SCoT 分子标记是一种单引物的标记，因此引物分别与模板的上游和下游结合，又由于该引物拥有较长的引物长度，重复性要好于RAPD 标记，并能有效产生和性状连锁的标记，方便分子标记辅助育种[16]。目前SCoT分子标记已经在甘蔗[17]、大豆、柑橘、花生、棉花、芥菜[18]和鹰嘴豆[19]等作物的遗传多样性分析得到了应用，虽然甜菜SCoT 体系已经建立并完成了引物筛选[20-21]，但还没有利用SCoT 引物进行品种鉴定的研究。因此，本研究拟利用筛选出的3条多态性较好的SCoT引物对15个已经登记的甜菜品种进行指纹鉴定，以期为甜菜品种的快速鉴定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试甜菜品种15个，见表1。

表1 甜菜品种名称及编号Table 1 Name and number of sugarbeet varieties

1.2 方法

1.2.1DNA提取

将15个甜菜品种种植在黑龙江大学呼兰校区试验基地，当甜菜幼苗长出4片真叶时，每个品种取10株。使用CTAB法[22]进行DNA的提取，最后利用超微量紫外分光光度计测量DNA的纯度及浓度，并将其浓度稀释至10 ng/µL的工作液。

1.2.2SCoT引物

从80 条引物中选择了3 条多态性相对较高、带型清晰、易分辨且重复性好的引物，它们分别是SCoT21、SCoT12和SCoT2（表2），引物由上海生工合成，HAP纯化，每条引物均稀释至10µmol/L备用。

表2 试验所用的引物名称及序列Table 2 Name and sequence of primers used in the test

1.2.3SCoT-PCR反应体系

PCR总反应体系为5µL，其中含有2.5µL 2倍的Mix，0.4µL引物，2µL模板DNA，最后加入灭菌去离子水补充至5µL，振荡混匀。

1.2.4SCoT-PCR反应程序

在94 ℃下预变性3 min；然后在94℃下进行45 s 变性，退火55 ℃45 s，最后在72 ℃进行40 s 的延伸；反应结束后，将其在72 ℃延伸5 min。

1.2.5聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测

在扩增后的产物中加入2µL Loading Buffer，用微孔板离心机进行离心。使用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶对扩增产物进行电泳检测，电泳缓冲液为0.5×TBE，180 V 恒压，电泳120 min。电泳结束后，利用快速银染法[23]进行漂洗、染色、显影成像，最后进行拍照记录。

2 结果与分析

3 条SCoT 引物扩增银染结果见图1，从图1 中可以看出，3 条引物均扩增出了清晰的条带，每一条扩增的条带多态性都非常好。利用分子标记技术鉴别品种的方法主要有特征谱带法、引物组合法和核心引物组合法[24]，引物组合法和核心引物组合法一般需要将扩增条带做成0、1 数据进行分析，比较复杂，由于SCoT 扩增条带多态性非常丰富，所以适宜于使用特征谱带法。本研究SCoT12 和SCoT12 这两条引物在15 个甜菜品种中就产生了15种不同的带型，即可把15个甜菜品种全部鉴别区分开；而SCoT2引物除了2号品种和9号品种难以鉴别外，能够区别其它13个品种。

图1 15个甜菜品种指纹图谱条带Fig.1 Fingerprinting strips of 15 sugar beet varieties

3 讨论与结论

目前，我国大多数植物品种纯度鉴定方法均采用形态识别鉴定法。然而形态识别方法具有长周期，识别工作量大，受环境条件或生物因素的影响等要素的制约，其弊端日益呈现，人为因素的影响比较高。

分子标记技术由于不受环境条件的影响，并且有识别时间短，精度高等优良特性。目前利用分子标记技术构建甜菜品种指纹图谱的国外文献有AFLP 技术[25]和SNP 技术[26]等，AFLP 分子标记技术虽然扩增的条带比较多，多态性较好，但由于此技术不仅有专利的限制，而且扩增条带过多，不易识别，另外该技术使用起来也比较麻烦，要经过一次酶切和两次PCR 扩增；而SNP技术虽然是未来发展的方向，但由于该技术目前使用起来还比较复杂，对仪器和设备要求很高，一般的单位难以应用。目前国内主要利用SSR[27]和ISSR[10]分子标记技术鉴定甜菜品种，SSR 分子标技术虽然扩增条带清晰、易于识别，但缺点是单个引物的多态性较小，一个引物一般只能鉴别2 个品种，如果鉴别品种较多，需要很多的引物组合；虽然个别ISSR 引物具有很好的多态性，单个引物能够鉴别多个品种，但缺点是多态性的引物较少。基于此，我们选择一种新的分子标记技术SCoT 对15 个甜菜品种进行品种真实性的鉴定。SCoT 分子标记具有高度多态性和可重复性，且实验获得的条带清晰，利用特征引物法，两条引物SCoT12 和SCoT21 单独使用均可鉴别全部15个甜菜品种，即使将来随着甜菜登记品种的增加，有个别品种在一条引物扩增时产生相同的条带，利用核心引物组合法也可以比较容易地实现对甜菜品种的鉴别。因此SCoT 分子标记技术在甜菜品种鉴定上的应用可以实现快速鉴定甜菜品种的目的，为保护甜菜育种家以及农民的利益，促进我国甜菜产业的健康发展发挥重要的作用。