壳聚糖对桑葚酒泥分离酒液的影响

许振，朱恩俊*

南京财经大学食品科学与工程学院/江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心/江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室（南京 210023）

桑葚也叫桑椹、桑果、桑枣等[1]，其本质是桑科桑属多年生草本植物桑树的成熟性聚合性多肉鲜果[2]，桑葚富含氨基酸、维生素及矿物质等多种人体所需营养成分[3]。桑葚可以增强人体免疫力，同时还具有改善人体血液循环等许多功效[4]。此外，我国桑树品种繁多，目前保存有近3 000份桑树种质资源[5]；种植面积广泛，分布在全国各地[6]。随着人们对健康生活的重视，具有多种保健功能的桑葚果实的深加工行业逐步兴起，桑葚酒的开发是其中最主要的加工方式[7]。桑葚酒业的发展未来可期，但因此带来的桑葚酒工业生产中产生的副产物的处理方法成了一大难题。

桑葚酒泥是桑葚酒在发酵结束后、贮存期间的处理中倒罐后得到的沉淀物或残渣，是桑葚酒的工业生产中的主要副产品[8]。现今工业生产桑葚酒过程中产生的桑葚酒泥大多用以饲料、肥料，或是直接弃置处理。桑葚酒泥中的含汁率极高，研究证明可达60%～70%，传统使用酒泥过滤机进行酒泥分离酒液的回收率不到10%[9]，因此，如何提高桑葚酒泥出汁率，是桑葚酒泥综合开发利用的一大关键。壳聚糖是一种天然的阳离子型高分子絮凝剂[10]，现已被广泛应用于红树莓果汁[11]、某些复合果汁[12]、食醋[13]、椪柑果酒[14]等产品的澄清工艺中，此外壳聚糖及其衍生物还被应用于一些生物膜的研究中[15-17]。壳聚糖结构中存在游离态氨基，在稀酸条件下易被质子化而带正电荷，表现出阳离子型聚电解质的性质，从而产生絮凝效果[18-19]。壳聚糖是由甲壳素经过脱乙酰胺基处理获得的，具有生物相容性、抗菌性、生物降解性等多种优良特性[20]。将壳聚糖应用到桑葚酒泥分离酒液中具有良好的发展前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑葚酒泥（句容市东方紫酒业有限公司）；壳聚糖（上海蓝季科技发展有限公司）；无水葡萄糖（科密欧化学试剂有限公司）；蒽酮（国药集团化学试剂有限公司）；硫酸、无水碳酸钠（南京化学试剂股份有限公司）；邻苯二甲酸氢钾、柠檬酸（西陇化工股份有限公司）；磷酸二氢钾、氢氧化钠（北京索莱宝科技有限公司）；酚酞（上海弘顺生物科技有限公司）；没食子酸（上海抚生生物科技有限公司）。试验所用水均为蒸馏水，试剂均为分析纯。

U-3900型紫外可见光光度计（上海菁华仪器有限公司）；Heidolph旋转蒸发仪（南京博然科学仪器有限公司）；HH-2型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；PHS-3E0酸度计（上海一恒科学仪器有限公司）；酒精计（浙江省余姚市方桥实验仪表厂）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（常州市金坛友联仪器研究所）；PRACTUM224-1CN电子天平（德国赛多利斯公司）；电炉；等。

1.2 试验方法

1.2.1 桑葚酒泥含汁率测定

用洗净干燥的喇叭口量筒（质量为M0，g）量取100 mL桑葚酒泥样品，测得总质量M（g），再将其放入45 ℃烘箱中干燥至恒质量，测得烘干后总质量M1（g），其质量差占比即为酒泥含汁率，多次测量取平均值，按式（1）计算桑葚酒泥含汁率。

1.2.2 桑葚酒泥分离提取

桑葚酒泥脱汁试验：取100 mL混合均匀的桑葚酒泥置于250 mL的烧杯中，然后加入一定量的壳聚糖，放置于水浴锅中搅拌，并精准控制温度和时间，将处理好的桑葚酒泥倒入布氏漏斗中用真空泵进行抽滤（每次抽滤的桑葚酒泥具体量根据布氏漏斗大小确定，滤纸上酒泥太厚会影响脱汁率），同时取100 mL桑葚酒泥样品不添加壳聚糖进行相同操作，作空白对照。根据抽出的滤液体积计算回收率，按式（2）计算。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 壳聚糖添加量对桑葚酒泥分离酒液的影响

准确称取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 g壳聚糖，分别放置于盛有100 mL桑葚酒泥样品的烧杯中，在25 ℃水浴锅中低速搅拌10 min后进行抽滤，记录滤液体积，并计算回收率。

1.2.3.2 搅拌温度对桑葚酒泥分离酒液的影响

准确称取0.6 g壳聚糖放置于盛有100 mL桑葚酒泥样品的烧杯中，分别在温度15，20，25，30和35 ℃恒温水浴锅中低速搅拌10 min后进行抽滤，记录滤液体积，并计算回收率。

1.2.3.3 搅拌时间对桑葚酒泥分离酒液的影响

准确称取0.6 g壳聚糖放置于盛有100 mL桑葚酒泥样品的烧杯中，在25 ℃恒温水浴锅中，分别低速搅拌6，8，10，12，14和16 min后进行抽滤，记录不同搅拌时间下的滤液体积，并计算回收率。

1.2.4 正交试验

完成单因素试验并对结果进行分析，在确定各因素最佳水平范围的基础上进行正交试验。对壳聚糖添加量、搅拌温度、搅拌时间三因素进行考察，以最终回收率为评价指标，进行L9(33)正交试验，正交试验各因素预估水平见表1。分析试验结果可获得壳聚糖分离桑葚酒泥酒液的最佳工艺条件。

表1 正交试验因素水平表

1.2.5 验证试验

分析单因素试验以及正交试验结果，得出最终最佳水平组合之后，根据最终最佳水平组合进行三个平行试验，将平行试验的结果与正交试验结果相对比，从而确定工艺是否可行。

1.2.6 壳聚糖对桑葚酒泥滤液的影响

以最佳工艺条件制备足量桑葚酒泥滤液A，同时制备足量不加入壳聚糖的空白桑葚酒泥滤液B，制备完成后避光封闭保存，备用。

1.2.6.1 壳聚糖对滤液酒精度的影响

量取A、B滤液各100 mL，分别放入蒸馏瓶中，再加入少许沸石，用旋蒸仪进行旋蒸，收集馏出液，至体积2/3时停止旋蒸。将馏出液转移至100 mL容量瓶中，定容，采用酒精计法对滤液酒精度进行测量。

1.2.6.2 壳聚糖对滤液色度的影响

分别吸取A、B滤液各10 mL，用0.45 μm微孔滤膜进行过滤，用酸度计测定两者pH，然后用磷酸二氢钠和柠檬酸钠制备出相对应的相同pH的缓冲液，用制备出的缓冲液分别对两种过滤后的滤液进行10倍稀释，最后在420，520和620 nm下测定稀释后滤液的吸光度，三个吸光度相加得出色度（OD值）[21]。

1.2.6.3 壳聚糖对滤液总糖含量的影响

吸取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL的葡萄糖标准溶液（1 mg/mL），分别放置于容量瓶中，加入水定容至10 mL，再加入5 mL蒽酮硫酸试剂，摇匀后水浴加热15 min，取出之后放入冰水浴中冷却至室温，测定吸光度，得出标准曲线。然后对A，B滤液进行相同操作测定吸光度，计算出总糖含量[22]。

1.2.6.4 壳聚糖对滤液干浸出物的影响

量取A、B滤液各100 mL，放于蒸馏瓶中，用电炉小火蒸发至原体积的1/3，将剩余滤液定容至100 mL，用密度瓶测得20 ℃下的密度ρ。以ρ×1.001 8的值，查找相关手册得出总浸出物含量。总浸出物含量与总糖含量之差即为干浸出物含量。

1.2.6.5 壳聚糖对滤液总酸含量的影响

根据GB/T 601—2016标定氢氧化钠标准滴定溶液[23]，吸取2 mL两种滤液样品，分别放置于三角瓶中，加入50 mL水，滴入少许酚酞指示液，摇匀。用制备完成的氢氧化钠标准滴定溶液滴定至终点，显色30 s，记录氢氧化钠标准滴定溶液消耗量，并计算总酸含量[24]。

1.2.6.6 壳聚糖对滤液总酚含量的影响

称取0.5 g没食子酸，加水溶解并定容至100 mL，制备成酚原液，备用。取0，1.0，2.0，3.0和10.0 mL，分别加到100 mL容量瓶中，定容。再各吸取1 mL加入另外100 mL容量瓶中，加入50 mL水后再加5 mL福林肖卡溶液，混合均匀后加入15 mL 200 g/L碳酸钠溶液，摇匀定容。室温下静置2 h。在750 nm下对各溶液进行吸光度测定，得出标准曲线。然后对A、B滤液进行相同操作测定吸光度，计算出总酚含量[25]。

2 结果与分析

2.1 桑葚酒泥含汁率和回收率测定

从表2可以看出，桑葚酒泥中桑葚酒的平均含量高达68.52%，同时直接进行抽滤的桑葚酒泥酒液的平均回收率仅有24.6%。因此有效地从酒泥中分理出桑葚酒汁是合理利用桑葚酒泥的一大突破口，在减少污染的同时还能产生经济效益。

表2 桑葚酒泥含汁率及回收率

2.2 单因素试验结果

2.2.1 壳聚糖添加量对桑葚酒泥分离酒液的影响

由图1可知，在一定区间范围内，随着壳聚糖添加量的增加，酒泥滤液体积逐渐增大，在0.6 g/100 mL时达到最大，此时滤液体积为44 mL，当继续提高壳聚糖添加量时，滤液体积逐渐减少。原因可能是壳聚糖添加量较少时，壳聚糖与酒泥不能充分接触，从而导致壳聚糖不能充分发挥絮凝效果；壳聚糖用量过多时，絮体可能在沉降过程中粘连而形成的大的絮团，使沉降阻力增大，导致絮凝效果不佳。

图1 壳聚糖添加量对桑葚酒泥分离酒液的影响

2.2.2 搅拌温度对桑葚酒泥分离酒液的影响

由图2可知，在一定范围内，随着温度的增加，滤液体积逐渐增大，当温度达到25 ℃时的絮凝效果最佳，滤液体积为44 mL；当温度超过25 ℃时，壳聚糖絮凝效果逐渐下降。原因可能是当温度较低时，壳聚糖分子运动速度相对缓慢，胶体颗粒间相互碰撞机会较少，同时也使得分布不均匀，难以形成絮体；当温度过高时，分子间运动则会由于过于剧烈而碰撞频繁，使得絮体难以稳定，从而影响絮凝效果。

2.2.3 搅拌时间对桑葚酒泥分离酒液的影响从图3可以看出，12 min时壳聚糖的絮凝效果能够达到最佳，此时滤液体积为45 mL，起初滤液体积随着搅拌时间增加而增加，当搅拌时间超过12 min时，滤液体积开始下降。这可能是搅拌时间不足时，壳聚糖在酒泥中分布不均匀，未达到最大的接触程度，而随着搅拌时间的增加，壳聚糖与酒泥充分接触，从而使得絮凝效果逐渐达到最佳，当搅拌时间过长时，原本分散均匀的壳聚糖分子遭到破坏，从而使得絮凝效果下降甚至丧失絮凝能力，同时酒泥中已经形成的絮体也可能因为搅拌过度而破碎，降低了絮凝效果。

图2 搅拌温度对桑葚酒泥分离酒液的影响

图3 搅拌时间对桑葚酒泥分离酒液的影响

2.3 正交试验结果

分析单因素试验的结果，确认正交试验各因素的预估水平无误。壳聚糖絮凝正交试验结果及极差分析见表3和表4。

经Minitab 17.0软件分析结果表明，以回收率为指标，因素壳聚糖添加量的极差最大，表明壳聚糖添加量的影响最大，各因素对回收量的影响程度依次为A（壳聚糖添加量）＞C（搅拌时间）＞B（搅拌温度），同时由试验结果表分析可知，其最佳工艺条件为A2B2C2，即壳聚糖添加量为0.6 g/100 mL，搅拌温度为30 ℃，搅拌时间为12 min。

方差分析分析见表4。A、C因素对回收率的影响达到显著性差异（p＜0.05），而B因素则没有表现出显著性差异。考虑到极差分析所确定的最佳水平组合，同时兼顾经济效益等因素，最终最佳工艺可确定为A2B1C2，即壳聚糖添加量为0.6 g/100 mL，搅拌温度为20 ℃，搅拌时间为12 min。

表3 壳聚糖絮凝正交试验结果

表4 以回收率为指标的方差分析

2.4 验证试验

根据各试验最终确定的最佳工艺条件进行验证试验，结果见表5。A2B1C2的平均回收率为44.33%，比正交试验所得到的结果（见表3）均高，可以说明该工艺条件具有可行性。

表5 最佳水平组合平行试验结果

2.5 壳聚糖对桑葚酒泥滤液的影响

壳聚糖对桑葚酒泥滤液部分理化指标的影响见表6。添加了壳聚糖的桑葚酒泥抽滤出的滤液酒精度等理化指标略微有所下降，与不添加壳聚糖的桑葚酒泥抽滤出的滤液基本持平，即壳聚糖对桑葚酒泥分离出的酒液性质不会产生显著影响。

表6 壳聚糖对桑葚酒泥滤液的影响

3 结论

利用壳聚糖较好的絮凝能力，将壳聚糖应用于桑葚酒泥分离酒液中，能够极大地提高桑葚酒液的回收率。在壳聚糖添加量0.6 g/100 mL、搅拌温度20 ℃、搅拌时间12 min条件下，工艺效果最好，回收率可超过40%。同时，加入壳聚糖之后桑葚酒泥分离得到的酒液与不添加壳聚糖所分离出的酒液理化指标无显著差距。因此，壳聚糖作为一种低成本且无污染的天然高分子絮凝剂，对桑葚酒泥分离酒液有着显著的积极影响，将其应用到桑葚酒泥分离酒液的中有着一定的研究价值，对桑葚酒泥的综合开发利用存在一定意义。