血管紧张素Ⅱ-1型受体自身抗体和缬沙坦对大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖与迁移的影响

2020-09-30王仲朝刘龙梅王家璞蔡雨晴杨霞

实用检验医师杂志 2020年3期

王仲朝刘龙梅王家璞蔡雨晴杨霞

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）是威胁人类健康的一类重大疾病。经皮冠状动脉（冠脉）介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）是目前冠心病血运重建的重要临床手段，因能快速、高效、安全地开通“罪犯血管”而被国内外各大指南推荐［1-2］。近年来，全球接受PCI治疗的人数不断增加，我国接受PCI 治疗人数的增加更为明显，但PCI 术后再狭窄（in-stent restenosis，ISR）严重限制了其远期血运重建效果。目前认为，PCI 过程中会损伤冠脉内皮细胞，撕裂血管内膜，引起血管重塑，因此，研究血管重塑中促进内皮细胞覆盖和抑制平滑肌细胞增殖的相关分子机制对揭示ISR 的发病机制从而及时给予临床干预至关重要。

血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）可作用于心肌细胞，导致心脏结构改变和心肌微血管内皮细胞功能障碍，与PCI 术后ISR 发展过程密切相关［3-4］。有研究表明，在不稳定性心绞痛患者外周血中存在AngⅡ-1型受体自身抗体（AngⅡ-type 1 receptor auto antibodies，AT1-AA）［5］，这种自身抗体可以通过激活AngⅡ-1型受体（AngⅡ-type 1 receptor，AT1R）加快乳鼠原代心肌细胞跳动频率、促进血管平滑肌细胞组织因子异常表达和活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成、损伤血管功能等与AngⅡ激活AT1R后类似的生物学效应，这种效应可部分被缬沙坦（valsartan，Val）阻断［6］。但是，关于Val 对AT1-AA 诱导平滑肌细胞增殖与迁移影响的研究并不多。本研究选用大鼠胸主动脉平滑肌A7r5 细胞，观察AT1-AA及Val 对细胞增殖和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器大鼠胸主动脉平滑肌A7r5 细胞（中国科学院上海细胞库）；DMEM 高糖培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自以色列BI 公司，青霉素-链霉素溶液、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）购自北京全式金公司，细胞增殖检测试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）购自东仁化学科技（上海）有限公司，AT1-AA（英国Abcam 公司），Val（鲁南贝特制药有限公司）；Herocell 180 CO2培养箱（赛默飞世尔科技有限公司），安图PHOMO酶标仪（郑州安图生物工程股份有限公司），ZEISS AXIO Observer A1 倒置显微镜（德国卡尔蔡司公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养 A7r5 细胞培养于含10% FBS、0.1 U/L 青霉素和100 mg/L 链霉素的DMEM 高糖培养基，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。每3 d 更换1 次培养基，每周按1：3 比例传代1 次。取对数生长期细胞完成后续实验。精密称量10 mg Val，加入二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）超声分散配制成50 μmol/L 的溶液，使用DMEM 高糖培养基稀释。

1.2.2 AT1-AA 对A7r5 细胞增殖的影响预先用DMEM 高糖培养基稀释AT1-AA。A7r5 细胞接种于96 孔板（5 000个/孔），待细胞贴壁生长至80%融合时弃去原培养基，加入含2% FBS 的培养基继续培养24h。向各孔中加入不同浓度（5、10、20 mg/L）AT1-AA 溶液，以不含药培养基作为对照组，每组设6个平行复孔。在培养箱中分别继续培养3、6、12、24h。培养结束后每孔加入10 μL CCK-8 孵育4h，用酶标仪检测450 nm 处吸光度（A 值）。按公式计算细胞存活率＝〔（A加药-A空白）/（A对照-A空白）〕×100%，并统一标准化处理数据。

1.2.3 Val 对AT1-AA 诱导的A7r5 细胞增殖的影响在96 孔板中接种A7r5 细胞悬液（5 000个/孔），分为空白对照组（不含药）、AT1-AA 最适浓度组、AT1-AA+Val（浓度分别为0.1、1、10 μmol/L）组，并设置重复孔，加入不同浓度Val 处理0.5、1、2、4h 后再加入20 mg/L AT1-AA，培养12h 后进行CCK-8 检测，计算细胞存活率。

1.2.4 AT1-AA 对细胞迁移的影响将A7r5 细胞接种于12 孔板，待细胞贴壁融合至80%时弃去上清，加入含2% FBS 培养基继续培养24h。然后用无菌200 μL 枪头在各培养板细胞生长单层相同位置划垂直线，用PBS 洗涤2 次去除脱落的细胞，随后对细胞进行处理，分为空白对照组（不含药）、AT1-AA 组（5、10、20 mg/L），继续培养3、6、12、24h后，在显微镜下观察细胞迁移距离。超过划线的细胞迁移最远距离即实际迁移距离，拍照并测定距离3 次，计算均值。根据细胞迁移距离测定结果，确定AT1-AA 诱导细胞迁移的最适条件。

1.2.5 Val 对AT1-AA 诱导的细胞迁移的影响将A7r5 细胞接种于12 孔板，分为空白对照组（不含药）、AT1-AA 最适浓度组、AT1-AA+Val（0.1、1、10 μmol/L）组，并设置重复孔，加入Val 预处理0.5、1、2、4h 后再加入10 mg/L AT1-AA 继续培养24h，在显微镜下观察并测定细胞迁移距离。

1.3 统计学方法使用SPSS 19.0 统计软件分析数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各浓度AT1-AA 作用不同时间对A7r5 细胞增殖的影响随着AT1-AA 浓度的升高，A7r5 细胞存活率呈升高趋势，表明AT1-AA 能够促进A7r5 细胞增殖。用20 mg/L AT1-AA 处理A7r5 细胞，细胞存活率随着作用时间的延长先升高后下降，以处理时间为12h 时细胞存活率最高（见表1）。因此以AT1-AA 20 mg/L 处理12h 为最适作用条件。

表1 各浓度AT1-AA 作用不同时间的A7r5 细胞存活率比较（±s）

注：AT1-AA 为血管紧张素Ⅱ-1型受体自身抗体；与对照组同时间点比较，aP＜0.05，bP＜0.01；以空白对照组细胞存活率为1

细胞存活率3h 6h 12h 24h空白对照组 6 1 1 1 1 AT1-AA 5 mg/L 组 6 1.02±0.01 0.95±0.00 1.11±0.15 a 1.11±0.00 a AT1-AA 10 mg/L 组 6 1.03±0.05 1.14±0.05 1.25±0.04 a 1.16±0.01 a AT1-AA 20 mg/L 组 6 1.05±0.06 1.23±0.20 a 1.43±0.07 b 1.24±0.05 b组别样本量（孔）

2.2 Val 对AT1-AA 诱导A7r5 细胞增殖的影响 Val 能抑制AT1-AA 诱导的A7r5 细胞增殖，不同浓度Val 预处理0.5h 后，用20 mg/L AT1-AA 处理12h，当Val 浓度为10 μmol/L 时，AT1-AA 诱导的A7r5 细胞存活率最低；当Val 预处理时间≥1h 时，0.1 μmol/L Val 组AT1-AA 诱导的A7r5 细胞存活率为同时间点最低。见表2。

表2 各浓度Val 预处理不同时间AT1-AA诱导的A7r5 细胞存活率比较（±s）

注：AT1-AA 为血管紧张素Ⅱ-1型受体自身抗体，Val 为缬沙坦；与AT1-AA 组同时间点比较，aP＜0.05；以空白对照组细胞存活率为1

细胞存活率0.5h 1h 2h 4h空白对照组 6 1 1 1 1 AT1-AA 组 6 1.40±0.05 1.39±0.04 1.40±0.04 1.39±0.05 AT1-AA+组别样本量（孔）0.1 μmol/L Val 组 6 1.04±0.05 a 1.01±0.04 a 0.89±0.03 a 0.82±0.21 a AT1-AA+1 μmol/L Val 组 6 1.08±0.01 a 1.13±0.02 a 1.08±0.04 a 1.03±0.05 a AT1-AA+10 μmol/L Val 组 6 0.88±0.02 a 1.09±0.01 a 1.09±0.04 a 0.93±0.19 a

2.3 AT1-AA 对A7r5 细胞迁移的影响 AT1-AA 能促进A7r5 细胞的迁移，相同浓度AT1-AA 处理A7r5 细胞不同时间，细胞迁移距离随着时间延长而增加。处理相同时间，A7r5 细胞的迁移距离随AT1-AA 浓度升高呈先增加后减少的趋势。当AT1-AA 浓度为10 mg/L 时，细胞的迁移距离较其他组远，当处理时间为24h 时，细胞迁移距离最远（见表3）。因此，AT1-AA 10 mg/L 处理24h 为最适处理条件。

表3 不同浓度AT1-AA 作用不同时间A7r5 细胞迁移距离比较（±s）

注：AT1-AA 为血管紧张素Ⅱ-1型受体自身抗体；与本组3h 比较，aP＜0.05，bP＜0.01

细胞迁移距离（μm）3h 6h 12h 24h空白对照组 3 6.05±2.53 21.03±4.74 35.60± 0.98 a 71.02± 0.54 a AT1-AA 5 mg/L 组 3 11.20±0.51 64.50±2.79 a 153.09±15.49 b 209.57±17.83 b AT1-AA 10 mg/L 组 3 12.10±0.44 57.33±1.64 a 171.39± 7.69 b 255.14± 9.51 b AT1-AA 20 mg/L 组 3 10.00±0.13 22.14±0.92 38.99± 0.29 a 109.72±16.45 a组别样本量（孔）

2.4 Val 对AT1-AA 诱导A7r5 细胞迁移的影响 Val能抑制AT1-AA 诱导的A7r5 细胞迁移，以0.1 μmol/L Val 预处理2、4h 或以10 μmol/L Val 预处理0.5、1h后，A7r5 细胞的迁移距离均明显低于其他处理组（均P＜0.05）。见表4。

表4 不同浓度Val 预处理不同时间AT1-AA 诱导的A7r5 细胞迁移距离比较（±s）

注：AT1-AA 为血管紧张素Ⅱ-1型受体自身抗体，Val 为缬沙坦；与AT1-AA+0.1 μmol/L Val 组同期比较，aP＜0.01

细胞迁移距离（μm）0.5h 1h 2h 4h空白对照组 3 60.28±3.01 60.87±3.22 61.98±2.97 62.09±2.68 AT1-AA 组 3 105.24±3.08 107.98±3.17 108.25±2.99 108.61±3.22 AT1-AA+0.1 μmol/L Val 组 3 61.34±2.78 66.37±3.41 10.05±0.93 9.38±0.96 AT1-AA+1 μmol/L Val 组 3 69.02±1.08 85.04±5.25 62.54±1.16 82.15±3.45 AT1-AA+10 μmol/L Val 组 3 14.57±3.01 a 16.35±1.20 a 83.11±3.52 59.44±3.09组别样本量（孔）

3 讨论

冠心病是一种慢性、终身性心血管疾病，近年来发病人数不断增加，且发病人群多集中于中老年人，对患者生命和生活质量造成了严重危害［7］。PCI可以迅速重建冠脉血运，是目前治疗急性心肌梗死（AMI）时间窗内的首选治疗方案［8-9］，目前PCI 术后半年再狭窄率高达10%［10］。PCI 过程会损伤冠脉内皮细胞，撕裂血管内膜，引起血管重塑，进而启动凝血反应，促进炎症发生，释放各种酶、生长因子和细胞因子等活性物质，诱导血管中膜的平滑肌细胞过度增殖并迁移到内膜，分泌大量细胞外基质，造成再狭窄发生［11-12］。有研究证实，快速内皮覆盖、恢复内皮功能进而减少平滑肌细胞增殖和迁移，抑制血管内膜增生，能够降低再狭窄发生率［13］。本团队前期研究［14］对PCI 后ISR 患者血清中AT1-AA 进行检测，发现再狭窄患者中AT1-AA 阳性率显著高于PCI 术后未发生再狭窄者，表明AT1-AA 可能参与PCI 术后再狭窄的发生发展［12］。

本研究采用CCK-8 法评估AT1-AA 和Val 对A7r5 细胞增殖的影响，结果显示AT1-AA 能促进A7r5 细胞的增殖，不同浓度AT1-AA 处理A7r5 细胞后，细胞存活率随着浓度的升高而升高，与对照组比较差异有统计学意义，且以20 mg/L AT1-AA处理A7r5 细胞12h 后的细胞存活率最高。此外，AT1-AA 促进A7r5 细胞增殖的现象可被Val 抑制，经不同浓度Val 预处理A7r5 细胞 0.5h，用20 mg/L AT1-AA 处理12h，10 μmol/L Val 对AT1-AA 诱导的A7r5 细胞增殖的抑制能力最强；预处理时间≥1h时，0.1 μmol/L Val 对AT1-AA 诱导A7r5 细胞增殖的抑制能力最强。

采用划痕试验法检测AT1-AA 和Val 对A7r5细胞迁移的影响，结果显示AT1-AA 能促进A7r5 细胞迁移，用不同浓度AT1-AA 处理A7r5 细胞相同时间，细胞的迁移距离随浓度升高呈先增加后减少的趋势。且以10mg/L AT1-AA 处理24h 后的细胞迁移距离较其他组远。此外，Val 能抑制AT1-AA 诱导的A7r5 细胞迁移，用0.1 μmol/L Val 预处理2、4h以及10 μmol/L Val 预处理0.5、1h 后，A7r5 细胞的迁移距离明显低于其他处理组。

综上所述，AT1-AA 能促进A7r5 细胞增殖和迁移，且AT1-AA 促进A7r5 细胞增殖和迁移的现象可被Val 抑制，间接提示Val 可能改善ISR，这与本团队之前进行的动物实验结果一致［14］。从血管内膜到血管中膜的验证结果提示，AT1-AA 对血管的影响在临床上应受到重视，而Val 的应用恰好减轻了AT1-AA 的影响，这为今后临床应用Val 预防ISR 提供了理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突