核磁共振波谱法测定液体乳中的1,2-丙二醇

李 玮 ，耿健强，许 华，林 立

(北京市食品安全监控和风险评估中心,北京 100094)

近年来中国奶业市场迅猛发展，液体乳产品所占市场份额巨大，特别是巴氏杀菌乳和灭菌乳以其营养价值高、便于携带和保存等特性占据了大片市场。国家标准中明确规定[1-3]，巴氏杀菌乳和包装上标有“纯牛(羊)奶(乳)”字样的灭菌乳仅以生牛(羊)乳为原料，不得添加任何辅料。但还是有不法厂商，为平衡奶源质量参差不齐，掩盖纯羊奶的特殊味道，以及满足消费者长期被误导的对纯奶口味“香”、“浓”的追求，违规向纯奶产品中添加奶味香精等食品添加剂。奶味香精配方多样，所含成分从几种到上百种不等[4-5]，对所有成分进行一一检测，难度较大，而且还会受纯奶原本含有的风味物质的干扰，实际可操作性不强。1,2-丙二醇(1,2-Propanediol)是食品添加剂标准[3]中规定的一种食品合成香料，同时也是食品工业中食用香精、香料常用的一种优良溶剂，常态下无色近乎无味，奶味香精多用其作为载体溶剂[5-6]。因此，对纯奶产品中的1,2-丙二醇进行测定，可在一定程度上间接反映产品中奶味香精的添加情况，对打击不法厂商的违规添加行为具有现实意义。

目前，1,2-丙二醇的测定多采用气相色谱法[7-10]，GB 5009.251-2016《食品安全国家标准 食品中1,2-丙二醇的测定》也采用气相色谱法对液体乳中的1,2-丙二醇进行测定[11]。但气相色谱法在实际样品检测中存在前处理操作繁琐，环境友好性、经济性差，难以避免假阳性结果，仪器检测时间长等缺点。核磁共振(Nuclear magnetic resonance，NMR)是一种基于自旋量子数不为零的原子核的磁性波谱学技术，与气相色谱法等色谱检测方法相比，具有前处理过程简单，取样量小，专属性强，无需对照品做参比即可同时定性、定量，脉冲组合丰富多样，可设计多种谱编辑手段，实验方式灵活多变等优点[12-16]。定量核磁共振( Quantitative nuclear magnetic resonance,qNMR)是建立在NMR基础上的定量方法，具备NMR分析方法的多种优点。鉴于qNMR技术的优点，近年来，采用该技术对乳制品中糖类、脂类、氨基酸类等多种营养物质进行测定的研究报道逐渐增多[17-18]。弛豫过程是NMR现象发生后得以保持的必要条件，为确保qNMR实验结果的准确性，应选取足够长的弛豫延迟时间，以保证质子信号的充分弛豫[19]。但弛豫时间的提升会增加仪器的采样时间，不利于检测效率的提高。同时，在食品等复杂混合物体系中仅以定量峰作为qNMR法的唯一定性指标，也会存在假阳性结果风险，难以满足检测需求。因此，在充分发挥qNMR技术优势的基础上提高检测效率，同时确保检测结果的准确性，是当前qNMR技术在食品检测领域应用及推广的关键。

鉴于上述问题，本研究首先采用1H NMR结合选择性一维全相关谱(1D total correlation spectroscopy，1D-TOCSY)技术，建立了液态乳中1,2-丙二醇的快速、准确定性筛查方法。在此基础上，采用1H NMR内标定量技术建立了无需对照品的液体乳中1,2-丙二醇含量的快速测定方法，具体流程见图1。采用上述分析方法，对市售10个品牌、批次的液体乳样品中的1,2-丙二醇进行筛查，并将阳性样品的测定结果与气相色谱检测结果进行比较。结果显示，本方法具有前处理简单，可避免假阳性，检测效率高等优点，既实现了样品的快速、精准筛查，又能准确测定目标物含量，非常适合液体乳中1,2-丙二醇的批量、快速检测，可为乳品的质量监管提供一种快速、准确的检测方法。

图1 NMR法测定液体乳中1,2-丙二醇的流程图Fig.1 Flow chart for determination of 1,2-propanediol in liquid milk by NMR method

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Bruker AVANCE 600 MHz超导傅立叶变换核磁共振仪(配有CPBBO探头，Topspin 3.2处理软件及60位自动进样器，美国Bruker公司)；XS204电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；Centrifuge 5424R离心机(德国Eppendorf公司)；7890B气相色谱仪(美国Agilent公司)。

1,2-丙二醇标准品(纯度≥99.5%，美国Sigma公司)；重水(D2O，氘代度：99.8%)、3-(三甲基硅基)氘代丙酸钠(TMSP)(美国CIL公司)；磷酸盐酸缓冲溶液(PBS,pH 7.4)(美国Thermo Fisher公司)。超滤离心管(3 kD)(美国Millipore公司)，Norell 5 mm核磁管(美国Norell公司)。

10个品牌巴氏杀菌乳和灭菌乳样品购于超市，未开启时常温保存，保质期内测定；开启后密闭容器内4 ℃保存，48 h内检测。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的制备标准品储备液配制：精密称取1,2-丙二醇标准品适量置于容量瓶中，用去离子水溶解并定容，摇匀，制得2 mg/mL的标准品储备液，4 ℃冰箱中储存备用。使用时放置至室温，按实际需要用去离子水稀释。

样品溶液制备：吸取1 mL液体乳样品于4 mL的3 kD超滤离心管中，于4 ℃下以12 000 r/min离心10 min。取超滤离心得到的样品液体420 μL于5 mm核磁管中，加入60 μL重水溶液(含5.00 μg的TMSP)和120 μL的PBS(pH 7.4)溶液，混匀后待测。

1.2.2 仪器条件1H NMR定性实验：使用Bruker仪器脉冲程序noesypr1d，检测温度298 K，谱宽12 019.230 Hz，中心频率2 814.61 Hz，脉冲延迟时间1 s，扫描次数32。

一维全相关谱(1D-TOCSY)实验：使用Bruker仪器脉冲程序selcssfdizs，检测温度298 K，谱宽12 019.23 Hz，中心频率690.80 Hz，混合时间0.5 s，扫描次数16。

1H NMR定量实验：使用Bruker仪器脉冲程序noesypr1d，检测温度298 K，谱宽12 019.230 Hz，中心频率2 814.61 Hz，脉冲延迟时间5 s，扫描次数64。

1.2.3 样品测定及谱图处理在“1.2.2”实验条件下，调整仪器参数、调谐、控温、匀场、采样及傅立叶变换，得到图谱。测得谱使用Bruker Topspin3.2软件处理，变换点数为64 K，线宽因子(LB)为1.00 Hz，用指数窗函数处理，基线和相位校正均采用手动方式进行，TMSP为内标信号(δ0.00)。

1.2.4 定量计算公式以TMSP为定量内标，按公式(1)计算样品中1,2-丙二醇的绝对含量。

(1)

式中：W为待测物的质量；A为定量峰积分面积；N为定量峰所包含的质子数；M为物质相对分子质量；下标p及t分别代表1,2-丙二醇和TMSP。

1.2.5 气相色谱法测定[11]准确吸取1,2-丙二醇标准储备溶液，用无水乙醇逐级稀释，配制成质量浓度分别为0.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0 μg/mL的1,2-丙二醇标准系列溶液。将标准系列工作液分别注入气相色谱仪中，测定相应的1,2-丙二醇的色谱峰面积，以标准工作液的质量浓度为横坐标，色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。准确称取混匀液体乳样品10 g(精确至0.01 g)于50 mL具塞比色管中，用无水乙醇定容，涡旋混匀2 min，静置1 h后用0.45 μm 有机相滤膜过滤，所得滤液进气相色谱仪分析。根据所得标准曲线计算样品中1,2-丙二醇的含量。

2 结果与讨论

2.1 液体乳中1,2-丙二醇的NMR定性方法

2.1.11H NMR图谱初步定性筛查选取不含1,2-丙二醇的液体乳作为空白基质样品，向其中添加一定量1,2-丙二醇标准品储备液作为加标样品。按照“1.2.1”操作方法分别制备空白样品、加标样品及标准品的待测溶液，测定其1H NMR谱，结果见图2。1,2-丙二醇标准品溶液的1H NMR谱质子信号数据归属结果见表1。通过对比空白样品、加标样品及标准品的1H NMR谱(图2A～C)可以得出，在加标样品中，1,2-丙二醇2位的次甲基、1位的亚甲基信号峰与液体乳中的乳糖信号峰相重叠，难以分辨，仅3位的甲基质子δ1.15(d,J=6.42 Hz)信号峰与图谱中的其他成分质子信号无重叠，易于辨识。因此采用1,2-丙二醇中甲基质子信号的化学位移值(1.15)、峰形(双重峰)及耦合常数(6.42 Hz)信息作为液体乳中1,2-丙二醇的初步定性筛查指标。

2.1.2 1D-TOCSY图谱二次精确定性由图2A可以看出，液体乳基质是一个复杂的混合物体系，所含成分多样，1H NMR图谱组成复杂。在实际检测工作中，仅以一个甲基质子信号作为液体乳中1,2-丙二醇的定性指标，难以避免假阳性结果出现。为提高定性结果的准确性，需在1H NMR图谱甲基质子信号定性的基础上进一步精确定性。1D-TOCSY为一维选择性NMR实验技术[20]，能够得到激发核及与其在同一自旋体系的质子信号。1,2-丙二醇的分子结构中含有1个甲基，1个亚甲基及1个次甲基，共6个非活泼氢质子，且这6个质子均在同一自旋体系内。通过对其甲基质子信号的选择性激发，可得到这6个质子的全相关谱。采用一维全相关脉冲对1H NMR检测得到的阳性样品中的δ1.15处的质子进行选择性照射，得到选择性1D-TOCSY图谱。若图谱中的信号数据与1,2-丙二醇标准品氢谱数据(表1)一致，则证明检测样品中δ1.15处的质子是1,2-丙二醇的甲基信号；若不一致，则表明检测样品中不含1,2-丙二醇成分。图2D为加标样品δ1.15处质子选择性激发的1D-TOCSY图谱，该图与标准品图谱(图2C)中的化学位移、裂分形式和耦合常数完全一致。

图2 液体乳及1,2-丙二醇标准品的NMR图谱Fig.2 NMR spectra of liquid milk and 1,2-propanediol standard solutionA.blank sample;B.spiked sample;C.standard sample;D:1D-TOCSY spectrum of spiked sample with selective excitation of 1H(δ 1.15)

表1 1,2-丙二醇的氢谱归属信息表Table 1 1H NMR data of 1,2-propanediol

2.2 液体乳中1,2-丙二醇的NMR定量方法

2.2.1 定量峰与内标物的确定对定性方法筛查出的阳性样本进行定量检测。首先，进行定量峰和定量内标物的选定。qNMR方法中被测物质的定量特征峰应易于识别，能与样品基质和内标物信号峰完全分离；在分子结构中最好化学环境近似(在图谱中表现为化学位移相近)。由于在液体乳基质中，1,2-丙二醇只有3位的甲基质子信号与其他物质无重叠(图2B)且化学位移值与TMSP最为近似。因此，选定δ1.15处的甲基质子信号作为定量峰，TMSP为定量内标物。

2.2.2 脉冲延迟时间的确定为避免样品信号饱和，需要的定量实验的脉冲延迟时间(D1)较长。通过设置不同的D1 时长，考察定量特征峰面积的稳定性，最终确定定量实验的D1为5 s。

2.3 方法学考察

2.3.1 检出限与定量下限在空白液体乳基质中，添加一定浓度的1,2-丙二醇标准品溶液，测定检出限和定量下限。以定量质子信号峰积分面积信噪比等于5计算检出限；定量质子信号峰积分面积信噪比等于15计算定量下限。结果显示，本方法的检出限为0.002 mg/mL，定量下限为0.006 mg/mL。

2.3.2 稳定性取同一空白液体乳加入一定量的1,2-丙二醇标准品储备液，按照“1.2.1”条件制备测定样品。分别在制备后0、2、4、8、12、24、48、72 h，于“1.2.2”条件下测定1H NMR图谱，计算得到各时间点图谱中1,2-丙二醇和内标TMSP定量峰比值(Ap/At)的相对标准偏差(RSD)为1.1%，确认供试品溶液在72 h内稳定性良好。

2.3.3 线性关系准确吸取一定量的标准储备液，分别置于已加有60 μL(含5.00 μg的TMSP)重水和120 μL缓冲液的6支核磁管中，各加一定体积的去离子水至600 μL，配制成质量分别为400、200、100、50、5、2.5 μg的标准样品，在“1.2.2”测定条件下进行1H NMR分析。以积分得到的标准品定量峰面积与内标峰峰面积比值为Y，以加入的标准品质量与加入的内标质量的比值为X作标准曲线。在标准品与内标质量比为0.5～80范围内，得到回归方程Y= 0.710 6X+0.119 0，r2=0.999 4，表明本方法线性关系良好。

2.3.4 回收率与相对标准偏差平行称取同一品牌空白液体乳样品6 份，各加入10 μL 2 mg/mL的标准品储备液。按“1.2.1”方法制备供试溶液，在“1.2.2”定量条件下测定1H NMR图谱，计算回收率和RSD。测得回收率为103%，RSD为1.9%,说明本方法的准确度和精密度良好。

表2 10个液体乳样品中1,2-丙二醇的含量Table 2 Contents of 1,2-propanediol in 10 milk samples(NMR & GC)

2.4 实际样品测定

称取不同品牌的液体乳样品，每个品牌样品取3份做平行(n=3)，制备供试品溶液。按照上述建立的定性方法对样品中的1,2-丙二醇进行筛查，并按照公式(1)计算阳性样品中1,2-丙二醇的含量。同时采用气相色谱法测定10 个未知样品中1,2-丙二醇的含量，结果见表2。结果显示，本方法与气相色谱法的测定结果较为一致,且无需标准物质作参比,操作简便,更适用于液体乳中1,2-丙二醇的批量、快速检测。

2.5 与现行国标(GC)方法的对比

本文建立的NMR法对含有1,2-丙二醇的阳性样本的检测时长为12 min 14 s，阴性样本仅为2 min 7 s，与现行的国标法(GC法)检测1个样品需19 min相比，显著缩短了检测时长，提高了检测效率。同时，1H NMR与1D-TOCSY技术的结合，能够实现阳性样本的精确定性，避免GC方法中因存在保留时间类似物引起的假阳性结果,且无需标准品，非常适合实际检测中液体乳中1,2-丙二醇的批量、快速检测。

3 结 论

本研究建立了准确、快速的液体乳中1,2-丙二醇的NMR定性、定量检测方法。首先，建立了液体乳中1,2-丙二醇的1H NMR谱快速定性检测方法(检测时长：2 min 7 s)，适于大批量样品中1,2-丙二醇的快速定性筛查；其次，针对液体乳基质复杂的特点建立了液体乳中1,2-丙二醇的1D-TOCSY精准定性方法(检测时长：1 min 35 s)，可完成对上述步骤中阳性样本的精确定性，最大程度地避免假阳性结果；最后，建立了液体乳中1,2-丙二醇的qNMR方法(检测时长：8 min 32 s)，可实现阳性液体乳样本中1,2-丙二醇含量的准确测定。1H NMR、1D-TOCSY及qNMR等多种NMR方法的有机结合，在提高检测效率的同时能够避免假阳性结果，非常适合实际检测中液体乳中1,2-丙二醇的批量、快速检测，为乳品的质量监管提供了一种高效、准确的检测方法。