PRIME-HLB固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱法同时快速检测粮食中4种真菌毒素的含量*

易珊珊， 杜鑫

(南充农产品质量监测检验中心，四川 南充 637000)

真菌毒素是真菌在生长繁殖过程中产生的次生代谢有毒产物，不易被烹调加热或加工破坏，具有生殖毒性、肾毒性、神经毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性等多种危害，对人和动物均可造成严重损害[1-3].据相关报道[4-6]，每年约有25%的小麦、玉米、高粱和大米等粮食在生产、加工、运输和贮存过程中，因发生霉变而产生有毒有害的真菌毒素,主要有呕吐毒素(deoxynivalenol，DON)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)和黄曲霉毒素B1(aflatoxins，AFTB1)等.

目前，常用胶体金免疫层析法[7]、酶联免疫ELISA试剂盒法[8]、免疫亲和柱-高效液相色谱法[9-13]及同位素稀释液相色谱串联质谱法[9-16]等检测真菌毒素.胶体金免疫层析技术和酶联免疫法主要用于快速筛选真菌毒素，属于半定量分析，且易受到基质干扰而定量不准.免疫亲和柱-高效液相色谱法具有选择性强及灵敏度较高等特点，但是只能测单一种类的真菌毒素，存在成本较高、试剂损耗大、耗时长和环境污染严重等缺点，不适用于同时检测复杂样品基质中的多种真菌毒素残留.同位素稀释液相色谱串联质谱法常用多功能(免疫)净化柱或固相萃取柱来净化样品提取液，在提取样品前加入了全碳标记的稳定同位素毒素内标来消除基质效应，但是稳定同位素内标价格昂贵，不易购买，导致试验成本很高.

因此，基于前期的液质串联检测技术[18-19]，研究建立了PRIME-HLB固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱法同时快速检测粮食中4种真菌毒素含量的方法，以期进一步提高检测效率，缩短分析时间，减少试剂损耗，并及时发现不合格样品，为农产品质量安全监管提供技术支撑.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

真菌毒素标准储备液DON (100.00 μg/mL，GBW(E)100304)、OTA (2.00 μg/mL，GBW(E)100303)、ZEN (20.00 μg/mL，GBW(E)100301)和AFTB1(2.00 μg/mL，GBW(E)100302)均购于国家粮食和物资储备局科学研究院，并用纯甲醇稀释配制成真菌毒素标准工作液，保存于4 ℃冰箱.Oasis PRIME-HLB小柱(6cc/500 mg，货号186008718,美国Waters公司)；甲醇、乙腈、正己烷、氨水及甲酸均为色谱级(美国Fisher公司).

Acquity H-Class型超高效液相色谱仪和Xevo TQ-S型三重四级杆串联质谱仪(美国Waters公司)，HS501型振荡摇床(德国IKA公司)，Vortex Genius 3型旋涡混合器(德国IKA公司)，3-18KS型高速冷冻离心机(Sigma(德国)公司)，ML802型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)，N-EVAP112型氮吹仪(美国Organomation公司)，Milli-Q型超纯水仪(美国Millipore公司)，离心管(康宁(上海)有限公司)，PTFE0.22 μm针孔式微孔滤膜(天津津腾实验设备有限公司).

1.2 样品提取

粮食样品经高速粉碎机粉碎混合均匀后过20目筛，称取5 g试样(精确至0.01 g)于50 mL离心管中，加入25.00 mL乙腈-水(体积比84∶16)提取液，涡旋混匀，置于摇床中振荡提取20 min，高速离心机10 000 r/min离心5 min，吸取上清液10 mL至50 mL离心管，加入10 mL乙腈饱和的正己烷除脂，高速冷冻离心5 min，吸取6 mL下层清液待净化.

1.3 样品净化

将待净化液直接通过PRIME-HLB固相萃取柱，收集滤液于15 mL离心管中，收集全部流出液，准确移取5.00 mL用氮气(45℃)吹至近干，再加入1.00 mL甲醇-水(体积比3∶7)混合溶液定容，涡旋混匀后过0.22 μm微孔滤膜，待上机检测.

1.4 仪器检测条件

色谱条件：Waters XBridge C18色谱柱(50 mm×3.0 mm,3.5 μm)，柱温40 ℃，样品室温度16 ℃，进样量2.00 μL；流动相为体积分数0.05%甲酸甲醇(A)+体积分数0.1%氨水溶液(B)+乙腈(C)；梯度洗脱程序详见表1.

质谱条件：电喷雾离子源的毛细管电压3.0 kV，以高纯氮气为脱溶剂气和锥孔气，脱溶剂气温度和流量为500 ℃和1 000 L/h，锥孔气流量为150 L/h，碰撞气为高纯氩气，其流量为0.10 mL/min.采用电喷雾正离子模式(Positive electrospray ionization,ESI+)、负离子模式(Negative electrospray ionization,ESI-)并选择多反应监测(Multiple reaction monitoring,MRM)方式采集数据.利用仪器“Intellistart”功能快速优化出的仪器参数见表2.

表1 超高效液相色谱流动相梯度洗脱程序

表2 4种真菌毒素的仪器检测参数

2 结果与讨论

2.1 流动相优化

在ESI+和ESI-电离模式下，试验初步选取甲醇(A相)、水(B相)和乙腈(C相)为流动相，向甲醇中加入少量甲酸，水相中加入少量氨水，对4种真菌毒素在不同流动相体系下进行了全扫描，分析响应信号强度，同时进试样观察目标物的保留时间、峰形和响应信号强度，优化后流动相体系见表1，所得的检测结果见图1.研究发现，采用甲醇-乙腈-水体系，加入少量甲酸和氨水后，不仅提高了目标物的离子化效率，而且有效改善了目标物的峰形，从而增强响应信号.

DON为呕吐毒素，OTA为赭曲霉毒素A，AFT B1为黄曲霉毒素B1，ZEN为玉米赤霉烯酮.

2.2 提取液优化

据文献[9-16]，真菌毒素的提取剂主要有甲醇-水和乙腈-水体系，试验发现采用混合液乙腈-水(体积比84∶16)和甲醇-水(体积比84∶16)为提取液时，4种真菌毒素的回收率均较好，鉴于乙腈-水体系沉淀粮食试样中蛋白质的效果优于甲醇-水，最终确定为乙腈-水(体积比84∶16)混合液为提取剂.

2.3 净化小柱优化

目前，固相萃取法是广泛使用的样品净化处理技术，根据净化原理分为目标物吸附型和杂质吸附型[17].为进一步去除提取液中脂肪、色素及蛋白质等干扰杂质，试验采用不同净化原理的固相萃取柱对样品进行前处理，主要考察了免疫亲和柱、多功能净化柱、C18小柱、HLB柱及PRIME-HLB柱，研究其对不同基质中的4种真菌毒素提取液的净化效果、基质效应及回收率的影响.

试验发现：多残留免疫亲和柱净化提取液过程耗时很长，且价格比较昂贵；多功能净化柱净化含油量高和色素深的高粱样品时，净化后的样品中仍含有较多悬浊物，净化不彻底，对仪器污染损害较大，且加标回收率约为50%；采用传统的反相固相萃取柱C18小柱和HLB柱净化样品时，耗时较长，4种真菌毒素回收率整体偏低，可能是由于这类小柱原理是吸附提取液中目标物，将杂质进行淋洗除去，但并非对特定毒素具有专一吸附性，在目标物吸附和杂质淋洗过程中，导致目标物损失.

Oasis PRIME-HLB是一种新型的反相固相萃取(SPE)小柱，不需要平衡活化可直接上样，属于过滤性去除杂质的固相小柱，极大简化和加速了SPE流程.比较未使用 PRIME-HLB柱净化和使用 PRIME-HLB 净化后的空白基质的响应信号，发现净化后的空白基质溶液更干净，上机背景响应信号也更低，表明PRIME-HLB能有效去除大部分磷脂、盐和蛋白等大部分基质干扰物，不仅基质效应更小，而且前处理过程更加高效快捷.

2.4 标准曲线和检出限

为补偿不同试样中某些基质对离子源电喷雾离子化效率及目标物离子信号强度抑制或增强效应，提高方法的选择性和准确性，配制混合空白基质匹配标准溶液来补偿基质效应.将真菌毒素混合标准工作液用小麦、玉米、大米和高粱试样的空白基质混合溶液稀释成一系列不同浓度的标准溶液，按仪器检测条件进行检测，以质量浓度为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标进行线性拟合绘制标准曲线，线性相关系数r为0.997 8～0.999 2， 线性良好.在目标物最低质量浓度附近添加一系列已知浓度的双份样品，测定其响应信号，用Masslynx V4.1软件计算信噪比(Signal-to-noise ratio,S/N)，方法检出限(Limit of detection,LOD)取S/N=3，方法定量限(The limits of quantification,LOQ)取S/N=10，结果见表3.

表3 4种真菌毒素检测的线性范围、线性相关系数、定量限和检出限

2.5 准确度和精密度

选取筛选后的小麦、玉米、大米和高粱等空白样品，进行加标回收试验.为模拟实样测定过程，试样加入真菌毒素标液后，轻微振荡离心管，密封避光过夜，让试样充分吸收毒素后，次日按照1.2-1.4节条件进行样品提取、净化及上机检测.以测定含量的平均值与参照值的百分比(回收率)来表示准确度.每个试样做6 个平行质控样品，以实测含量的相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)表示精密度.由表4可以看出，小麦、玉米、大米和高粱等样品的低、中、高3个水平的加标试验回收率均介于75.5%～98.6%，RSD不大于6.6%，符合食品理化检测的要求[20]，表明本方法的准确度和精密度均满足实样检测需求.

表4 方法回收率和精密度测定结果

2.6 实样检测

选取某地送检的疑似真菌毒素超标样品进行了复核，每个样品做3个平行，结果见表5.查判定标准[21]，判定小麦中ZEN超标，玉米中ZEN和AFTB1均超标，高粱中OTA超标，大米(粳米)中仅检出了少量AFTB1，但未超标.

表5 粮食中4种真菌毒素含量测定结果

3 结 语

基于PRIME-HLB固相萃取净化技术，试验建立了超高效液相色谱串联质谱法快速同时测定粮食中DON、OTA、ZEN和AFTB1等4种真菌毒素含量的方法，该方法具有检出限低、稳定性好、回收率高且速度快等优点.利用该方法对小麦、玉米、大米和高粱等样品中的真菌毒素进行测定，耗时少，检测结果准确，可为粮食及其制品中多种真菌毒素的检测和农产品质量安全监管提供技术支撑.