乙醇-硫酸铵双水相萃取柚子皮中黄酮类化合物的研究

韩秋菊，王晨，李薇，李晓楠

(辽宁石油化工大学 化学化工与环境学部，辽宁 抚顺 113001)

柚子为芸香科植物柚的成熟果实。成熟的柚子味道酸甜、凉润，营养价值和药用价值都很高，是最具食疗功效的水果之一。柚子皮可用于清热去火，去油解腻，也可醒酒、助消化。柚子皮中的黄酮类物质包括柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、芸香苷等，具有抗炎、抗病毒、镇痛、降血压的作用，能降低血液中的胆固醇，减少血栓的形成，可用于预防和治疗心脑血管类疾病[1-3]。柚子皮既厚且大，占柚子重量的20%～30%，又富含黄酮类化合物，是提取黄酮类物质的理想原料。本研究利用双水相萃取法从柚子皮中萃取黄酮类化合物，为更充分地开发利用柚子资源提供依据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

柚子皮(新鲜沙田柚果皮)；芦丁标准品、硫酸铵、乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯。

HH-4数显恒温水浴锅；FW100高速万能粉碎机；AR522CN电子天平；721s可见光分光光度计；HZQ-C恒温振荡培养器。

1.2 实验方法

1.2.1 材料预处理 柚子皮用蒸馏水反复冲洗后，切成1～2 cm2的小块，50 ℃干燥箱中干燥72 h，粉碎机粉碎。

1.2.2 柚子皮中黄酮类化合物的萃取 称取适量乙醇、硫酸铵配制萃取剂，加入25 mL的比色管中，按照液料比35∶1准确称取适量的柚子皮粉末，在 40 ℃ 下振荡萃取1.5 h。分别测定上下相液体的体积和黄酮含量，经由公式(1)～(4)可求得双水相的总黄酮萃取率及得率。

R=Vt/Vb

(1)

其中，R为相比；Vt和Vb为体系上、下相的体积。

K=Ct/Cb

(2)

其中，K为黄酮分配系数，Ct和Cb为上、下相的黄酮质量浓度。

X=1/[1+1/(R×K)]×100%

(3)

其中，X为黄酮萃取率，%。

Y=Ct×Vt×n/m

(4)

其中，Y为黄酮得率，mg/g，Ct为上相黄酮浓度；Vt为上相萃取液的体积；m为柚子皮样品质量；n为稀释倍数。

1.3 芦丁标准曲线的绘制

称取芦丁标准品10 mg，用50%的乙醇溶解，定容至50 mL，制备0.2 mg/L的芦丁标准溶液。分别将0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL的芦丁标准溶液加入25 mL比色管中，加入30%的乙醇定容至 10 mL。加入1 mL 5%的亚硝酸钠溶液，摇匀后静置6 min。加入1 mL 10%的硝酸铝溶液，摇匀后静置6 min。最后加入10%的氢氧化钠溶液10 mL，用30%的乙醇定容至25 mL，静置15 min。510 nm处测定各组溶液吸光度值，绘制芦丁标准曲线，回归出线性方程y=0.553 4x-0.001 6，R2=0.999 5。

2 结果与讨论

2.1 双水相萃取柚子皮中黄酮类化合物最佳萃取体系的确立

液料比、萃取时间、萃取温度不变，分别考察硫酸铵和乙醇质量分数对柚子皮中黄酮类化合物萃取效果的影响，结果见图1、图2。

图1 硫酸铵质量分数对柚子皮黄酮得率、 萃取率和分配系数的影响Fig.1 Effect of ammonium sulfate mass fraction on flavonoids yield，extraction rate and flavonoid partition coefficient

由图1可知，柚子皮中黄酮类化合物得率在硫酸铵的质量分数为30%的时候最大。萃取率和黄酮分配系数均随着硫酸铵质量分数的增加而增加。

由图2可知，柚子皮中黄酮类化合物得率在乙醇质量分数为35%的时候最高，随着乙醇质量分数增加，萃取率和黄酮分配系数均出现先增加后下降的趋势。在后续实验中双水相体系乙醇的质量分数选取35%，硫酸铵的质量分数选取30%。

图2 乙醇质量分数对柚子皮黄酮得率、 萃取率和分配系数的影响Fig.2 Effect of ethanol mass fraction on flavonoids yield，extraction rate and flavonoid partition coefficient

2.2 单因素实验

分别考察萃取温度、时间、液料比对黄酮得率的影响。结果显示，最佳萃取温度为40 ℃，最佳萃取时间为1.5 h，最佳液料比为35∶1。

图3 单因素实验考察柚子皮黄酮的萃取条件Fig.3 Study of grapefruit peel flavonoids extraction conditions by single factor experiments

2.3 响应面实验优化双水相体系的萃取条件

2.3.1 响应面实验结果 依据单因素实验的结果设计响应面实验，以柚子皮中总黄酮得率为评价指标，优化萃取工艺条件。因素与水平见表1，结果见表2。

表1 响应面实验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

表2 响应面实验结果Table 2 The results of response surface experiment

2.3.2 响应面实验分析 实验数据回归拟合以后，响应值与测试变量之间的关系可以用以下多元二次回归方程来描述：

Y=44.39+5.61A+4.08B-2.99C-2.66AB+4.18AC+1.26BC-0.73A2-3.39B2-3.59C2

回归模型方差结果分析见表3。

表3 回归方程模型方差Table 3 Variance of regression equation model

由表3可知，模型P为0.003 3<0.01，极显著。模型R2=0.926 5，说明模型与实际实验拟合情况良好。失拟项P值是0.245 3>0.05，不显著，表示方程拟合不足检验不显著，变化系数值7.35%，显示出很高的精密度等级和实验值很高的可靠性。实验考察的3个因素P值均<0.05，影响均显著，各因素影响由强到弱依次为：萃取温度>萃取时间>液料比。各个实验因素对其响应值的影响不是简单的线性关系，交互项中AC的影响显著(P值是0.019 2<0.05)。

2.3.3 响应面图解析 等高线图和3D响应面图表示各影响因素中任意一个变量取零时，其余两个因素对黄酮得率的影响。

由图4可知，柚子皮黄酮得率随萃取温度的上升呈现先增后降的趋势，近50 ℃时萃取的总黄酮量最高。黄酮得率随着萃取时间延长呈现先增后减的变化趋势，萃取时间1.6 h时，黄酮类化合物的得率达到了最大值。黄酮得率随液料比增大呈现先增后减的趋势，液料比35∶1时，黄酮类化合物的得率达到最大值。交互项AC的响应面图走势较陡，影响显著，与P值分析结果一致。

图4 萃取温度(A)、萃取时间(B)和液料比(C)对黄酮得率影响的等高线和3D响应面图Fig.4 Contour map and 3D response surface graph showing the effects of extraction temperature(A)，extraction time (B) and liquid-solid ration (C) on the yield of flavonoids

2.4 验证实验

由响应面分析软件预测，柚子皮黄酮的最佳萃取条件为：萃取温度50.00 ℃，萃取时间1.62 h，液料比36.05∶1。模型预测柚子皮黄酮得率49.57 mg/g。为实际操作的可行性，最佳条件优化为：萃取温度 50 ℃，萃取时间1.6 h，液料比36∶1，在此条件下进行3次验证实验，得到柚子皮黄酮的实际黄酮得率为(48.22±3.04)mg/g。

3 结论

采用双水相法萃取柚子皮中黄酮的最佳条件为：硫酸铵质量分数30%，乙醇质量分数35%，萃取温度为50 ℃，萃取时间为1.6 h，液料比为36∶1。该条件下，黄酮类化合物的得率为(48.22±3.04)mg/g。