响应面法优化百合多糖的超声辅助提取工艺

侯敏娜,侯少平,吴满芳，刘艳红，彭修娟，许海燕

(1．陕西国际商贸学院,陕西 咸阳 712046；2.都昌县第二人民医院，江西 九江332600)

百合(Liliumbrownii)为百合科百合属植物卷丹的干燥肉质鳞叶[1]，味甘性寒，归心肺二经，具有较高的食用和药用价值。百合含有多糖、甾体皂甙、酚类化合物、黄酮类化合物和生物碱等多种活性成分，其中多糖含量较高[2-3]，用于治疗咳嗽痰多、心烦惊悸、失眠等症[4-6]。现代药理研究表明，百合在抗疲劳、抗抑郁、抗肿瘤、降血糖、抗氧化、免疫调节、止咳等[7-10]方面有很好的疗效。植物多糖的提取方法主要有溶剂法、酶法、超声辅助法、微波法等。作者采用超声辅助法提取百合多糖，在单因素实验的基础上，以液料比、提取时间、超声功率、提取次数为考察因素，以百合多糖得率为评价指标，采用响应面法优化百合多糖的提取工艺，以期为百合多糖的大规模工业化生产提供参考依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

百合，购于甘肃兰州中药材批发市场，经陕西国际商贸学院中药教研室雷国莲教授鉴别为百合科百合属植物卷丹。

葡萄糖标准品(批号2014041)，中国药品生物制品鉴定所；浓硫酸，天津化学试剂有限公司；苯酚，天津盛奥化学试剂有限公司；所用试剂均为分析纯。

KQ5200DE型超声波提取仪，昆山超声仪器有限公司；TGL-15B型离心机，上海安平科学仪器厂；TU-1810型紫外分光光度计，上海长城制造有限公司；YP20002型电子天平，上海越平科学仪器有限公司；HH-2型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司。

1.2 百合多糖的提取及精制

将干燥的百合药材切成小片，置于干净的烧杯中，按一定液料比加入适量蒸馏水，浸泡1 h。将浸泡液超声提取后，抽滤，滤液浓缩至原溶液体积的1/4，加入4倍体积的95%乙醇，静置过夜，沉淀即为百合粗多糖。将百合粗多糖加入氯仿-正丁醇混合液中，采用Sevag法[11-12]除去蛋白质，即得精制后的百合多糖。

1.3 百合多糖得率的测定

1.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

将葡萄糖标准品置于105 ℃干燥箱中干燥至恒重，精密称取0.005 0 g，置于50 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.1 mg·mL-1的葡萄糖标准溶液。分别精密吸取葡萄糖标准溶液0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于20 mL容量瓶中，加蒸馏水至2 mL；再加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 mL，摇匀，40 ℃水浴加热30 min，取出，冰水冷却10 min；另取2.0 mL蒸馏水作空白对照；测定490 nm处吸光度。以葡萄糖浓度(c)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.2 百合多糖得率的计算

将百合多糖置于60 ℃干燥箱中干燥后，精密称取4 mg，置于50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，得样品溶液。精密吸取样品溶液1 mL，按1.3.1方法测定百合多糖在490 nm处吸光度，根据标准曲线计算多糖浓度，按下式计算百合多糖得率(Y)[13-14]：

式中：c为多糖浓度， mg·mL-1；V为溶液体积，mL；n为稀释倍数；m为百合质量，mg。

1.4 百合多糖超声辅助提取工艺优化

1.4.1 单因素实验

分别考察液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，mL∶g，下同)、提取时间(3 min、4 min、5 min、6 min、7 min)、超声功率(300 W、400 W、500 W、600 W、700 W)、提取次数(1次、2 次、3 次)对百合多糖得率的影响，确定各因素的适宜范围[15-19]。

1.4.2 响应面实验

在单因素实验的基础上，以百合多糖得率为评价指标，以液料比(A)、提取时间(B)、超声功率(C)、提取次数(D)为考察因素进行4因素3水平Box-Behnken实验,设计29组响应面实验优化提取工艺。响应面实验的因素与水平见表1。

表1 响应面实验的因素与水平

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖标准曲线(图1)

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

拟合得葡萄糖的线性回归方程为：A=0.9703c+0.0175，R2=0.9982。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 液料比对百合多糖得率的影响

在超声功率为400 W、提取时间为5 min、提取2次的条件下，考察液料比对百合多糖得率的影响，结果见图2。

图2 液料比对百合多糖得率的影响Fig.2 Effect of liquid-soild ratio on yield of Lilium brownii polysaccharides

由图2可以看出，随着液料比的增大，即提取溶剂用量的增加，百合多糖得率先升高后降低，当液料比为20∶1时，百合多糖得率达到最高，为1.97%。可以初步推断，溶剂用量过少时，多糖不能充分溶出；溶剂用量过多时，会引入更多的杂质，导致多糖得率降低。故选择20∶1为液料比的中心实验点。

2.2.2 提取时间对百合多糖得率的影响

在超声功率为400 W、液料比为20∶1、提取2次的条件下，考察提取时间对百合多糖得率的影响，结果见图3。

图3 提取时间对百合多糖得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on yield of Lilium brownii polysaccharides

由图3可以看出，随着提取时间的延长,百合多糖得率先升高后降低，当提取时间为4 min时，百合多糖得率达到最高，为1.93%。提取时间较短(少于4 min)时，提取不完全，多糖得率低；当提取时间较长(超过4 min)时，多糖结构可能被破坏，使得多糖含量减少。故选择4 min为提取时间的中心实验点。

2.2.3 超声功率对百合多糖得率的影响

在液料比为20∶1、提取时间为4 min、提取2次的条件下，考察超声功率对百合多糖得率的影响，结果见图4。

图4 超声功率对百合多糖得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on yield of Lilium brownii polysaccharides

由图4可以看出，随着超声功率的增大,百合多糖得率先升高后降低而后趋于稳定，当超声功率为400 W时，百合多糖得率达到最高，为1.98%。可能是因为，超声功率较小时，超声波能量较低，不能有效提取多糖；当超声功率过大时，一些非糖物质也被提取出来，影响多糖测定，致使多糖得率降低。故选择400 W为超声功率的中心实验点。

2.2.4 提取次数对百合多糖得率的影响

在液料比为20∶1、提取时间为4 min、超声功率为400 W的条件下，考察提取次数对百合多糖得率的影响，结果见图5。

图5 提取次数对百合多糖得率的影响Fig.5 Effect of extraction times on yield of Lilium brownii polysaccharides

由图5可以看出，百合多糖得率在超声提取2次时达到最高，为2.96%，超过2次后明显下降。可能是由于，连续2次的提取使多糖的结构被破坏或者物料的水溶液变得黏稠，多糖溶出困难。故选择2次为提取次数的中心实验点。

2.3 响应面实验结果

2.3.1 响应面实验设计与结果(表2)

表2 响应面实验设计与结果

2.3.2 回归模型的建立和方差分析

通过Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行分析，得到多元二次回归模型方程为：Y=12.76+0.38A+0.72B+0.17C+0.28D-0.14AB-0.25AC+0.57AD+0.81BC-0.13BD+0.060CD-0.35A2-0.084B2-0.81C2-1.49D2。

对该模型进行方差分析，结果见表3。

表3 方差分析

即该模型可以解释 93.58%响应值的变化，模型拟合程度较好，说明该模型可以对不同条件下百合多糖得率进行预测。此外，提取时间的一次项和提取次数的二次项高度显著，提取时间和超声功率的交互项、超声功率的二次项极显著。由F值可以得出各因素影响百合多糖得率的大小依次为：提取时间(B)>液料比(A)>提取次数(D)>超声功率(C)。

2.3.3 响应面分析

根据回归分析结果，使用Design-Expert 8.0.6软件绘制各因素交互作用对百合多糖得率影响的响应面图和等高线图，结果见图6。

由图6a可以看出，液料比与提取时间的响应曲面均向下弯曲，但液料比的弯曲程度更大，表明液料比的二次项对百合多糖得率影响更大。确定两因素最佳水平参数范围：液料比(15～20)∶1、提取时间3～4 min,在此范围内百合多糖得率最高。

图6 各因素交互作用对百合多糖得率影响的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface map and contour map for effect of interaction between each factor on yield of Lilium brownii polysaccharides

由图6b可以看出，液料比与超声功率的响应曲面均向下弯曲，超声功率的弯曲程度更大，表明超声功率的二次项对百合多糖得率的影响更大。确定两因素最佳水平参数范围为：液料比(20～30)∶1、超声功率400～500 W，在此范围内百合多糖得率最高。

由图6c可以看出，液料比与提取次数的响应曲面均向下弯曲，提取次数的坡度更陡，表明提取次数的二次项对百合多糖得率的影响较大。等高线呈椭圆形，二者的交互作用显著。确定两因素最佳水平参数范围为：液料比(20～30)∶1、提取次数2～3次，在此范围内百合多糖得率最高。

由图6d可以看出，提取时间与超声功率的响应曲面均向下弯曲，超声功率的弯曲程度更大，表明超声功率的二次项对百合多糖得率的影响更大。等高线呈椭圆形，二者的交互项显著。确定两因素最佳水平参数范围为：超声功率400～500 W、提取时间3～4 min，在此范围内百合多糖得率最高。

由图6e可以看出，提取时间与提取次数的响应曲面都有弯曲，两者对百合多糖的得率均有影响，提取次数的弯曲程度更大，故对百合多糖得率的影响更大。等高线接近圆形，二者的交互作用不显著。确定两因素最佳水平参数范围为：提取时间3～4 min、提取次数2～3次，在此范围内百合多糖得率最高。

由图6f可以看出，超声功率与提取次数的响应曲面均向下弯曲，提取次数的坡度更陡，说明提取次数的二次项对百合多糖得率的影响更大。等高线呈椭圆形，二者的交互作用显著。确定两因素最佳水平参数范围为：提取功率400～500 W、提取次数2～3次，在此范围内百合多糖得率最高。

2.4 工艺验证

通过响应面法处理实验数据得到百合多糖的最佳超声辅助提取工艺为：液料比20.5∶1、提取时间4.3 min、超声功率400 W、提取次数2次，百合多糖预测得率为13.150%。考虑实际操作情况，将最佳超声辅助提取工艺修正为：液料比21∶1、提取时间4 min、超声功率400 W、提取次数2次。在此条件下，进行3次验证实验，百合多糖平均得率为12.936%，与百合多糖得率预测值(13.150%)接近。

3 结论

在单因素实验的基础上，以液料比、提取时间、超声功率、提取次数为考察因素，以百合多糖得率为评价指标，采用响应面法优化了百合多糖的超声辅助提取工艺。确定最佳提取工艺为：液料比21∶1 (mL∶g)、提取时间4 min、超声功率400 W、提取次数2次，在此条件下，百合多糖得率为12.936%，与预测值(13.150%)相差0.214%。