声遗传技术的研究进展

王天歌

(天津大学生命科学学院，天津 300072)

超声波是一种在医学领域得到普遍认可的物理媒介，具有安全性高、成本低、应用便捷等独特优势，目前已在临床的各个领域得到了广泛应用，涉及各类器官和医学分支，例如用于医学成像和诊断的低强度超声波以及用于击碎结石和肿瘤组织等的高强度超声波。近年来，随着国家提出要满足重大疾病早期诊疗的要求，同时结合物理和工程等学科的技术发展，已经开发出很多基于超声波的新型技术，声遗传技术也随之应运而生。这一技术的思路来自于光遗传技术，光遗传技术是通过激光调控光敏蛋白进而调控细胞活动的一种新兴技术，近年来备受关注并且在神经科学等领域取得了很多研究成果[1-2]。然而由于光遗传技术利用激光作为细胞调控手段，仍然存在一些需要改善的问题，如穿透性低、定位不够精准、需要手术植入光纤以及激光热效应较强等[3-4]。声遗传技术凭借特有的非侵入性、精准调控性、高安全性等优势[5-6]，能够弥补光遗传技术的一些缺陷，有望成为继其之后极有发展前景的一项细胞调控技术。

声遗传技术的原理(图1)主要是：通过基因工程技术将机械敏感通道蛋白的基因转入目的细胞，利用超声波调控细胞特异性表达的机械敏感通道蛋白进而调控细胞的行为活动。其中所用的机械敏感通道蛋白可以感受超声波产生的机械力从而打开通道，使细胞内外的小分子主要是离子通过通道流动，离子在细胞的很多重要行为活动中都起着关键的调控作用，因此通过不同的通道蛋白调控不同的离子流动即可调控相应的细胞行为。目前已经研究发现的机械敏感通道蛋白的种类有很多，但应用于声遗传技术研究的仅有几种，主要包括大电导机械敏感离子通道(mechanosensitive channel of large conductance，MscL)、瞬时受体电位(transient receptor potential，TRP)离子通道、双孔钾通道家族(channels of the two-pore-domain potassium family，K2P)和Piezo离子通道等[7]。它们大多数都能够对低强度的超声波产生响应，因此，声遗传技术中所使用的超声波对机体的损伤极小。作者对声遗传技术的应用进行综述，包括神经细胞调控、目的基因表达调控及肿瘤细胞死亡调控等方面，并对声遗传技术面临的机遇和挑战进行分析，以期为声遗传技术的进一步深入研究和发展提供参考。

图1 声遗传技术原理示意图Fig.1 Schematic diagram of principle of sonogenetics technology

1 声遗传技术的应用

目前，对各类机械敏感通道蛋白的分子结构及开放机理等特性已经研究的比较透彻，并且在构建性能更好的突变体蛋白方面也得到了一定的发展，通道蛋白在动物细胞中的表达和对超声波的响应性也得到了验证。如Doerner等[8]证明了来源于原核生物的 MscL野生型和突变体蛋白可以在哺乳动物细胞中成功表达并发挥作用；Heureaux等[9]利用偶联到细胞表面的微泡对超声波强度的放大作用，成功通过低强度超声波调控MscL的开放。这些研究为声遗传技术在各方面的应用奠定了重要的基础。

1.1 在神经细胞调控方面的应用

声遗传技术最先在调控神经细胞放电领域得到应用。超声波作为损伤极小、穿透能力很强的介质用于刺激神经元放电具有很大的优势，可以安全传入大脑深层。研究者曾单独使用超声波来刺激几种模型生物的大脑神经元簇，但作用范围较广，无法刺激单个神经元细胞，精确度很低[10-12]。利用声遗传技术能够通过打开特定离子通道来激活特定的神经细胞，虽然目前只停留在低等生物个体与哺乳动物细胞层面，但有望为大脑神经调控提供一种精确度高、调控效果好的新策略。

1.1.1 激活神经元

Ibsen等[13]研究了在线虫神经元上表达的TRP-4通道蛋白对低强度超声波的响应性，以及由此产生的神经元激活和线虫行为活动改变。发现，TRP-4通道蛋白对低强度超声波敏感性很弱，不能直接被激活，但可以借助微气泡将低强度的机械信号放大，从而使负压峰值在0.4～0.6 MPa之间的低强度超声波可以特异性激活表达TRP-4通道蛋白的神经元。该研究中利用的全氟己烷微泡目前已被广泛用作体内超声造影剂[14-16]，可以通过静脉注射在体内循环并保持1 h左右，为机械敏感性较低的通道蛋白在声遗传技术中的应用提供了一个安全而有效的辅助工具。他们还发现，利用超声波激活特异性表达TRP-4通道蛋白的不同神经元，会导致不同的线虫个体的行为改变。例如，激活ASH和AWC感觉神经元会增加线虫的大角度逆转行为，而激活PVD神经元则会抑制这种行为。这一研究为探索不同的神经元在影响动物个体行为方面的功能提供了一种全新的、非侵入性的方法。而且，TRP-4通道蛋白不具有哺乳动物同源性[17-18]，因此，在哺乳动物大脑中表达这些通道蛋白相对来说是很安全的，有望在哺乳动物中得到进一步应用。

1.1.2 改变细胞膜电位

神经元的激活依赖于细胞膜电位的改变，即动作电位的产生。一些研究针对声遗传技术对细胞膜电位的影响进行了探索。Kubanek等[19]研究了聚焦超声在调节K2P离子通道的K+电流和Nav1.5通道的Na+电流中的作用。发现，频率为10 MHz、功率为0.3～4.9 W·cm-2的聚焦超声能够刺激细胞产生平均约23% 的膜电流升高，证明了聚焦超声可以成功激活机械敏感离子通道从而改变膜电位。他们还发现，超声波刺激可以使表达Na+或Ca+机械敏感通道的细胞产生兴奋，而对表达K+机械敏感通道的细胞产生抑制。该研究首次在单细胞水平上探究了超声波对机械敏感离子通道的影响，证明了超声波可以调节流经特定离子通道的电流，并且这些离子通道在神经元、视网膜、心脏等多种组织中都有表达[20-21]，具有广阔的研究前景。

Ye等[22]研究了低强度超声波在刺激哺乳动物细胞产生动作电位中的应用，在原代培养的大鼠海马体神经元中特异性表达了MscL的功能获得突变体蛋白MscL I92L，该突变体蛋白对超声波的响应更敏感，在超声波的负压峰值低至0.25 MPa时就可以开启，并成功触发细胞产生动作电位。MscL I92L不需要微泡或其它配体的介导，并且其表达对神经元细胞原本的电生理特性和存活情况没有影响。因此，MscL I92L有潜力发展成为一种通用的调控神经元或其它细胞活动的非侵入性声遗传工具。

1.2 在目的基因表达调控中的应用

离子不仅与细胞的膜电位有关，还可以通过激活信号通路来启动细胞核内基因的转录从而调控蛋白的表达。因此，声遗传技术可以利用超声波打开机械敏感离子通道，通过内流的特定离子启动相应的基因表达，实现对细胞蛋白表达的非侵入性精准调控。Pan等[23]利用低强度超声波结合微泡打开表达在细胞上的Piezo离子通道，通过孔道内流的Ca2+在细胞质内可以使磷酸酶活化，活化T细胞核因子(NFAT)在磷酸酶的作用下发生去磷酸化反应，随后转运至细胞核，在核内与上游转录元件相结合，从而启动下游目的基因的转录和后续的蛋白表达。下游目的基因为可编程式，这一策略可以成功调控各种贴壁或悬浮细胞对荧光素酶和GFP等蛋白的表达。在此基础上，他们设计了嵌合抗原受体(CAR)的Ca2+启动表达基因，成功利用超声波调控T细胞中CAR蛋白的表达，并对肿瘤细胞具有识别和清除作用，实现了癌症免疫治疗的精准声控。这一策略可以利用超声波对活细胞中的基因表达进行无创的远程调控，具有高时空精准性，并且通过对目的蛋白基因的设计，可以扩展为对不同类型细胞的不同功能蛋白表达的调控，在癌症等疾病治疗方面有广阔的应用前景，也为神经科学等其它方向提供了新的思路。

1.3 在肿瘤细胞死亡调控中的应用

以上介绍的声遗传技术应用都是基于短时间或脉冲式的超声波，在机械敏感离子通道短暂性开启的过程中，其触发的离子流动对细胞的活性及正常生理活动不会产生影响。而Wen等[24]在最新的研究中针对通道持续性开启对细胞的影响进行了探索，他们利用MscL的两种突变体蛋白V23A-MscL和G26C-MscL，V23A-MscL是一种功能获得型突变体，它的通道能够在正常生理环境下自发性开启，而G26C-MscL是一种化学响应型突变体，它会对其化学活化剂MTSET产生响应从而打开通道。他们发现，MscL的持续性开启会破坏细胞内正常的稳态环境，从而导致细胞胞浆空泡化坏死，并且在小鼠肿瘤模型中具有抑制肿瘤细胞生长的作用，为癌症治疗提供了一种新的策略。目前还没有将这种细胞死亡诱导策略与超声波的调控功能相结合的研究应用，这可能是声遗传技术极有潜力的后续发展方向。

2 声遗传技术面临的机遇和挑战

声遗传技术的开发和发展为生物学的调控技术提供了全新的策略，但作为一种新兴技术，目前其研究和应用范围仍十分有限，并且存在一些需要解决的问题，主要包括：(1)目前已发现的机械敏感通道蛋白种类很多，但适用于声遗传技术的很少，对各类蛋白超声响应性的研究和对性能更好的突变体蛋白的构建是促进声遗传技术发展的重要基础。(2)目前大部分声遗传技术利用的通道蛋白都需要借助微泡等配体提高其对超声波的敏感性[9，25]，限制了部分方向的应用。(3)需要进一步研究和完善适用于声遗传技术的各类型超声仪器，以配合不同的应用条件和需求。(4)声遗传技术的效果很大程度上依赖于细胞对机械敏感通道蛋白的表达效果，目前很多研究利用病毒进行转染，仍存在一些争议，因此需要进一步提高蛋白转染的安全性和表达效率。

声遗传技术目前虽然还不够成熟，但其存在的问题有望通过后续的研究得到完善，并且其应用领域有望得到进一步拓展。总的来说，声遗传技术提供了一种通过外界手段非侵入式调控细胞行为及功能的全新策略，为神经科学、免疫学、疾病治疗等领域都开拓了新的方向，并且以其非侵入性、精准调控性、高安全性、强穿透性等独特优势，有望弥补目前调控手段的不足，并成为未来极有发展前景的重要技术。