豨莶草提取物对膝骨关节炎大鼠软骨组织损伤及NOX2/ROS/NF-κB通路的影响

董桦，李桂华，赵娜，杜书浩

天津中医药大学第一附属医院，天津300193

膝骨关节炎(KOA)是中老年人群最常见的关节炎，其发病特点以关节软骨退行性改变导致的关节软骨损伤、破坏、关节软骨边缘和软骨下骨反应性增生及骨赘形成为主[1]。目前KOA的西医治疗主要包括非甾体药物抗炎镇痛、腔内注射、关节镜介入以及截骨术、关节置换术等。西医治疗起效快，但不容易兼顾“经济简便、长期有效”的治疗目标。相比之下，传统中医药治疗骨关节炎在经济疗效综合效益方面有一定的优势[2]。豨莶草是治疗关节骨痛的传统中药，具有补益肝肾、强筋壮骨之效，常用于治疗痛风性关节炎、风湿性关节炎等。现代药理研究表明，豨莶草中的有效化学成分二萜类、倍半萜类、黄酮类等，具有较好的抗氧化应激效果，具有抗炎、镇痛作用[3，4]。NADPH氧化酶2(NOX2)/活性氧(ROS)/核因子κB(NF-κB)通路是氧化应激和炎症反应相关的通路，在类风湿关节炎[5]、痛风性关节炎[6]等多种关节骨病中促进病情发展。目前关于豨莶草治疗骨关节炎的报道较少。2019年8～11月，我们采用豨莶草提取物对KOA大鼠进行干预，观察其对膝关节软骨组织病理损伤的影响，并探讨其与NOX2/ROS/NF-κB通路的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠75只，体质量210～230 g，(21±2)周龄，购于广东省医学实验动物中心。鼠房饲养，环境温度21～24 ℃，湿度50%～60%，循环照明模拟昼夜(12 h/12 h)，正常饲喂。

1.1.2 豨莶草提取物制备 豨莶草饮片购自广州南北行中药饮片有限公司。将饮片粉碎成粗粉，加入75%乙醇，反复加热回流提取，过滤。将滤液稀释10倍，减压蒸馏获得浓膏，再在冷冻干燥机冷阱中超低温脱水，获得棕黄色固形物。粉碎后取5 g溶于100 mL生理盐水，配制成50 mg/mL的溶液。

1.1.3 试剂与仪器 骨组织番红和固绿染色液(上海经科化学科技有限公司)；ROS指标丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒(M-MLV)、BCA浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；兔抗NOX2多克隆抗体、兔抗NF-κB多克隆抗体、兔抗GAPDH单克隆抗体和HRP标记的羊抗兔IgG(英国Abcam公司)；ECL化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。酶标仪(美国Molecular Devices公司)；倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯株式会社)，RT-PCR仪(瑞士罗氏公司)。

1.2 动物分组与模型制作 将大鼠随机分为假手术组、模型组以及豨莶草低、中、高剂量组，每组15只。采用碘乙酸钠诱导构建KOA模型[7]。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，向双侧后肢膝关节腔注射50 μL碘乙酸钠生理盐水溶液，假手术组注射等体积生理盐水。实验第4、7、11、14天重复上述步骤。除注射碘乙酸钠当天外，其余时间均进行转轮锻炼，转轮速度设置为7 r/min，锻炼时长30 min/d。实验第18天结束锻炼，完成建模。模型组大鼠膝关节解剖中观察到膝关节内侧间隙狭窄，关节平面粗糙且边缘粗糙有骨赘生成，表明建模成功。

1.3 干预方法 造模成功后，豨莶草低、中、高剂量组分别给予75、150、300 mg/kg豨莶草提取物经口灌服，假手术组和模型组给予1.2 mL生理盐水经口灌服，1次/d，连续3周。结束给药24 h后，每组15只大鼠中随机取6只用于组织学鉴定，其余9只用于MDA、SOD、NOX2、NF-κB检测。

1.4 膝关节软骨损伤评价 大鼠麻醉，沿体中线开胸，暴露心脏。将灌流针头插入左心室，剪破右心房上端腔静脉。打开灌流泵，先快速灌入150 mL生理盐水，待心房流出清水样液体后，慢速灌入4%多聚甲醛。取出后肢双侧膝关节，加入4%多聚甲醛固定，EDTA脱钙处理4周。乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，将胫骨平台外侧软骨下松骨质和股骨外侧髁软骨下松质骨沿下肢纵轴方向切片，切6 μm厚切片。将切片脱蜡至水，先滴加固绿染液处理3 min，蒸馏水冲洗；然后滴加媒染剂处理30 s，蒸馏水冲洗；最后滴加番红染液处理1 min，蒸馏水冲洗。乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，白光明场拍照。采用13分制，依据软骨组织结构、细胞分布、组织着色程度及潮线情况进行Mankin分级评分[8]。

1.5 膝关节软组织MDA含量和SOD活性检测 MDA含量检测采用硫代巴比妥酸法，SOD活性检测采用氮蓝四唑法。大鼠断颈处死，拨开双侧后肢皮肤，切下膝关节软骨，放于EP管中低温保存。取冷冻组织研磨成组织匀浆，取0.1 g匀浆加入检测试剂盒中的提取液，冰浴混匀。4 ℃离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书操作。

1.6 膝关节组织NOX2、NF-κB mRNA表达检测 采用RT-PCR法。取大鼠膝关节软骨组织，使用总RNA提取试剂盒提取总RNA，分光光度法测定总RNA含量，纯度符合要求后，使用cDNA试剂盒逆转录合成cDNA。反应条件：37 ℃ 15 min，90 ℃ 5 s，4 ℃ 15 s。引物序列：NOX2上游引物5′-CCAGTGAAGATGTGTTCAGCT-3′，下游引物5′-GCACAGCCAGTAGAAGTAGAT-3′；NF-κB上游引物5′-TTGGATTTTCCACAGCCGTAG-3′，下游引物5′-AGAGTTACCTGGCCTGCAGG-3′；GAPDH上游引物5′-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3′，下游引物5′-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3′。以cDNA为模板进行扩增。扩增条件：90 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算NOX2、NF-κB mRNA的相对表达量。

1.7 膝关节组织NOX2、NF-κB蛋白表达检测 采用Western blotting法检测。向匀浆组织中加入蛋白提取液，12 000 r/min、4 ℃离心15 min，用BCA试剂盒检测总蛋白含量和纯度。取蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并电转移到PVDF膜上，脱脂牛奶封闭。分别加入一抗(稀释比例：兔抗NOX2为1∶100，兔抗NF-κB和兔抗GAPDH均为1∶200)，0 ℃孵育过夜。加入二抗(稀释比例为1∶100)室温孵育30 min。使用增强的化学发光剂ECL显色，凝胶成像仪曝光、拍照，Image Pro Plus6.0软件分析电泳条带，计算IOD值。以目的条带与内参条带IOD比值表示目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组膝关节Mankin评分比较 假手术组、模型组以及豨莶草低、中、高剂量组的Mankin评分分别为(0.83±0.47)、(10.32±0.87)、(7.62±0.92)、(5.85±1.09)、(3.06±0.65)分。与假手术组相比，模型组Mankin评分升高；与模型组相比，豨莶草各剂量组Mankin评分均降低，其中高剂量组低于中、低剂量组(P均<0.05)。

2.2 各组膝关节软骨组织MDA含量和SOD活性比较 见表1。

表1 各组膝关节软骨组织MDA含量和SOD活性比较

2.3 各组膝关节软骨组织NOX2、NF-κB mRNA表达水平比较 见表2。

表2 各组膝关节组织NOX2、NF-κB mRNA表达水平比较

2.4 各组膝关节软骨组织NOX2、NF-κB蛋白表达水平比较 见表3。

表3 各组膝关节组织NOX2、NF-κB蛋白表达水平比较

3 讨论

KOA属中医学“痹症”和“膝痹”范畴。传统中医认为，KOA发生的机制为“风寒湿合，经络阻滞”，治疗以活血化瘀、宣痹通络为主[9]。豨莶草性味苦寒，归肝、肾经，具有补益肝肾、强筋壮骨之效，能通经活络、行痹止痛，与KOA证型相合。此外，豨莶草提取物中的生物活性成分二萜类、倍半萜类、黄酮类等具有镇痛消炎、抗氧化应激的效果，可改善骨关节炎的相关症状[10]。本研究结果显示，与模型组相比，豨莶草不同剂量组Mankin评分均降低，其中高剂量组低于中、低剂量组,表明豨莶草提取物能够显著改善膝骨关节炎大鼠的组织病理损伤，高剂量组效果更佳。

研究显示，氧化应激可直接导致骨损伤和骨细胞凋亡，关节滑膜炎症，影响软骨细胞合成代谢，导致软骨退化，是KOA病情发展的一个重要因素[11，12]。氧化应激是机体产生过量的自由基、ROS、活性氮，使内环境的氧化还原平衡被破坏的现象。ROS是氧化应激的主要产物，也是反映氧化应激程度的主要指标。活细胞中ROS可以通过二氯二甲基硅烷荧光染色直接测定，而在组织中ROS主要是通过氧化(如MDA)和抗氧化(如SOD)指标间接反映。其中MDA与ROS呈负相关，SOD与ROS呈正相关，因此推测MDA上升而SOD下降时ROS上升，反之亦然。ROS在炎性发生过程中发挥重要的作用，其可作为第二信使激活NF-κB等炎性信号通路上的关键因子，进而导致TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子的级联反应。这些炎症因子能激活未成熟的破骨细胞侵蚀骨质，干扰软骨细胞代谢促使软骨降解产生不可逆的纤维化，从而加重KOA[13]。本研究结果显示，豨莶草不同剂量组MDA水平低于模型组，SOD水平高于模型组，且高剂量组的变化程度较中、低剂量组更明显，表明豨莶草提取物能有效抑制大鼠膝关节组织的氧化应激反应，高剂量组效果更佳。

NOX2/ROS/NF-κB通路是氧化应激和炎症反应相关的通路。NOX是ROS过量产生的关键跨膜蛋白，NOX2是NOX的典型代表，在巨噬细胞中表达丰富。机体静息状态下，除吞噬细胞中NOX2不会活化生成ROS外，其他细胞中NOX都有一定的活化，作为信号分子和基因开关维持细胞正常的增殖分化凋亡；在病原体、炎症介质、机械损伤等作用下，细胞NOX大量转录激活，产生大量ROS，参与机体的宿主防御[14]。随着KOA病情发展，滑膜和脂肪垫巨噬细胞随之增多，加重膝骨关节损伤、滑膜炎和软骨损伤。Sakurai等[15]报道，滑膜巨噬细胞通过增加炎性介质，加重对环氧合酶抑制剂耐药的晚期关节炎的疼痛程度。Marlein等[16]报道，NOX2异常升高可促进骨髓脂肪和破骨细胞生成，参与有害的骨重塑过程。因此推测，抑制NOX2/ROS/NF-κB通路可能改善膝骨关节炎。本研究结果显示，豨莶草不同剂量组NF-κB、NOX2 mRNA及蛋白水平均低于模型组，且随剂量增大而降低；而SOD水平高于模型组，随剂量增大而升高。由此可见，豨莶草提取物剂量能抑制NOX2/ROS/NF-κB通路激活，从而抑制大鼠膝关节组织的氧化应激及炎症反应，减轻膝关节组织病理损伤，对膝骨关节炎具有显著治疗效果。