纯化学合成缓冲蛋白胨水培养基的研制*

张国勇 曲 萍 邓自新* 董培智 崔生辉

（1山西省食品药品检验所，山西太原 030031）

（2中国食品药品检定研究院，北京 100050）

缓冲蛋白胨水培养基（BPW） 是一种非选择性增菌培养基，可用于沙门氏菌预增菌培养。该培养基配方中添加蛋白胨为微生物提供碳源与氮源，其他无机盐维持培养基渗透压。国内外对缓冲蛋白胨水培养基的研究主要比较不同厂家培养基对沙门氏菌预增菌效果的影响，以及在此基础上进行的沙门氏菌预增菌试验。Han 利用吸光度和平板计数法比较8 种厂家培养基对沙门氏菌预增菌效果的影响；

Weng 等以缓冲蛋白胨水培养基为基础，加入适合浓度的促进剂、抑制剂以及营养物质制成共增菌培养基SSSV；Gao 利用50 株菌评价即用型缓冲蛋白胨水培养基的灵敏度和特异性。Beckers P 比较了缓冲蛋白胨水培养基和TBB 培养基在检测沙门氏菌及肠杆菌中的预增菌效果。目前，缓冲蛋白胨水培养基（BPW） 用到的蛋白胨、牛肉膏、酵母粉等复杂成分，来源不明，加工工艺混乱，缺乏统一的质量控制标准，导致成品的批间差异较大，可变因素多，质量难以控制，且存在引入外源性病毒的安全隐患，进而影响试验结果的准确性。因此，研制由分子结构清晰、可溯源的纯化学合成食品微生物参比培养基，构建客观、准确、可操作性强的培养基评价体系，势在必行。

纯化学合成培养基（Chemically Defined Culture Medium） 由已知分子结构和纯度的化学成分配制而成。纯化学合成培养基用化学成分替代了天然成分，质量稳定可靠。目前，纯化学合成培养基已广泛用于提高发酵产物的产量，I.A.El-Kady 等用纯化学培养基发酵葡萄穗霉使维鲁卡林J 产量提高到11.8 mg/L；Hyun-Koo Nam 等将甘油加入到含氨基酸的纯化学合成培养基中，发酵重组基因的大肠杆菌DH5a，提高了β-胡萝卜素产量。纯化学合成培养基亦可增加细菌生长量，Angela Restrepo 等探究纯化学合成培养基对巴西副球菌生长量的影响；Kadri Aller 等配制纯化学培养基培养乳糖乳杆菌IL1403，结果表明谷氨酰胺、天冬氨酸有利于乳糖乳杆菌的生长，同时支链氨基酸可以提高细菌生长率；Yu Chen 等开发优化了可促进凝结芽胞杆菌高密度生长的纯化学合成培养基；VartanovaNO 等合成一种新布鲁氏菌培养基培养幽门螺旋杆菌，除加入血红蛋白外，培养基中还加入铁离子、谷氨酰胺保证幽门螺旋杆菌生长。还有关于细菌快速检测纯化学合成培养基的报道，Feng 等根据大肠杆菌发酵乳酸产酸产气的特性开发了纯化学合成培养基，用于快速检测大肠杆菌。

根据国标GB 4789.28—2013《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂》的质量要求，缓冲蛋白胨水培养基的质控菌株为鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 菌株。采用非选择性分离和计数固体培养基的目标菌生长率定量测试方法，在盐溶液的基础上，添加多种氨基酸、维生素、无机盐多次重复筛选出可以促进鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 生长的物质，合成新的纯化学缓冲蛋白胨水培养基。

1 材料与方法

1.1 材料

试验菌株：鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium，ATCC14028），-80 ℃冰箱保藏，由中国食品药品检定研究院提供。

培养基：营养琼脂、MH 培养基、脑心浸出液培养基，广东环凯微生物公司；营养肉汤，北京三药科技公司；缓冲蛋白胨水培养基，美国BD 公司。

试剂：氨基酸、维生素、无机盐等，Sigma 公司。葡萄糖盐溶液：葡萄糖4.0 g/L、磷酸氢二钠6.78 g/L、磷酸二氢钾3.0 g/L、氯化钠0.5 g/L、氯化铵1.0 g/L。

仪器：法国梅里埃高智能全自动微生物分析系统VITEK2；Thermo 全波长酶标仪Multiskan GO 等。

1.2 菌悬液制备

将鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 在脑心浸出液培养基中活化，36 ℃培养过夜，取新鲜过夜菌液涂布于MH 琼脂培养基，36 ℃过夜培养，取MH 平板上培养过夜的二代沙门氏菌新鲜培养物，用棉签刮取至无菌生理盐水中，调制McFarland 值为1.0 左右的菌悬液，用无菌水稀释1 000 倍，备用。

1.3 细菌OD600 值的测定

将细菌36 ℃培养4 h、24 h、48 h 后，将96 孔板培养物置于混悬仪悬1 min～2 min，反复颠倒混匀待其膜上无水汽，迅速置于酶标仪测量600 nm波长处的吸光度值。

1.4 单个成分筛选

用葡萄糖盐溶液作溶剂，将每种单一成分配制成高中低3 种不同质量浓度的溶液，具体见下页表1。在96 孔板中按比例逐一添加各种溶液，每种物质设置3 种浓度梯度，每个浓度重复3 个孔，再加入上述菌悬液使得最终浓度达到103CFU～104CFU，用96 孔板封膜封板，36 ℃培养。

1.5 7 种物质基础上筛选

在7 种有效成分（甲硫氨酸、维生素C、胱氨酸二盐酸盐、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸镁、硫酸锰） 的混合液基础上逐一添加其余39 种成分进行第二轮筛选。用葡萄糖盐溶液作溶剂，将筛选的7 种成分按最适浓度混合，配制成混合液，在此基础上添加39 种物质，每个物质设置3 个浓度，每个浓度重复3 个孔，每孔中加入适量菌悬液使得最终浓度达到103 CFU～104 CFU，用96 孔板封膜封板，36 ℃培养。

表1 单个成分及其质量浓度

1.6 8 种物质中有效成分筛选

筛选出8 种成分（甲硫氨酸、维生素C、胱氨酸二盐酸盐、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸镁、黄嘌呤、硫酸锰） 进行最适物质筛选。分别用葡萄糖盐溶液做溶剂，配制溶液方法如表2 所示。

表2 混合物质配制方法

1.7 自制纯化学培养基与市售培养基比较

根据之前试验结果，按照配方（葡萄糖4 g/L、硫酸镁0.05 g/L、磷酸氢二钠6.78 g/L、磷酸二氢钾3.0 g/L、氯化钠0.5 g/L、氯化铵1.0 g/L） 制成纯化学合成缓冲蛋白胨水培养基，与市售BPW 培养基、营养肉汤做对比，在96 孔板中按比例逐一添加各种溶液，每种物质设置3 种浓度梯度，每个浓度重复3 个孔，每孔中加入适量菌悬液，使得最终浓度达到103CFU～104CFU，用96 孔板封膜封板，36 ℃培养。

1.8 数据分析

统计分析采用SPSS 17.0 软件单因素方差中的LSD 多重比较法，使用Excel 2010 和GraphPad 7.0分析数据及制表绘图。

2 结果与分析

2.1 单个成分筛选结果

葡萄糖盐溶液作为对照组，添加氨基酸、维生素以及无机盐等46 种成分分别配制成高中低不同质量浓度溶液，逐一筛选出对鼠伤寒沙门氏菌有促生长作用的7 种物质，且7 种物质质量浓度与促生长能力相关。7 种物质对细菌生长影响结果如图1所示。由图1 可知，硫酸镁、胱氨酸二盐酸盐高浓度与中浓度、低浓度在促进细菌生长方面存在差异（P<0.05），两者中浓度与低浓度无差异，且低浓度硫酸镁、胱氨酸二盐酸盐效果好；维生素C 中浓度与高、低浓度在促进细菌生长方面存在差异（P<0.05），故中浓度维生素C 效果好；硫酸锰高浓度与中浓度在细菌生长方面存在差异（P<0.05），低浓度与高、中浓度无差异，选用低浓度硫酸锰；甲硫氨酸、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤的高中低3 种浓度均无差异，故低浓度较宜。

图1 7 种有效成分不同浓度对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028生长影响

最适浓度的7 种物质对沙门氏菌促生长能力比较结果如图2 所示。由图2 可知，与对照组相比，7 种物质对细菌促生长能力存在差异（P<0.05）；其中低浓度硫酸镁与对照组存在显著性差异（P<0.01）；分析得知，低浓度硫酸镁对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 生长影响较大；其余6 种物质甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸二盐酸盐、维生素C、硫酸腺嘌呤、硫酸锰均促进细菌生长，但影响较弱。

图2 最适浓度的7 种有效成分对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 生长影响

7 种最适浓度物质对鼠伤寒沙门氏菌生长影响如图3 所示。由图3 可知，培养4 h 后，7 种物质均无明显生长，培养24 h 时硫酸镁培养的细菌OD600值达到0.35，甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸锰培养的细菌OD600值达到0.18，维生素C 培养的细菌生长缓慢，48 h 后OD600值才达到0.15，培养48 h 后甲硫氨酸培养的细菌开始进入衰亡期，其余6 种物质培养的细菌均有所增长，且生长缓慢。

图3 最适浓度的多种有效成分对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 生长曲线

2.2 7 种物质基础上的筛选结果

为了探究2 种或者多种物质联合是否会促进鼠伤寒沙门氏菌的生长，在46 种物质筛选的7 种有效成分（甲硫氨酸、维生素C、胱氨酸二盐酸盐、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸镁、硫酸锰） 混合液基础上逐一添加39 种成分进行第二轮筛选。通过试验在7 种有效成分的基础上筛选出促进鼠伤寒沙门氏菌生长的有效成分黄嘌呤，不同质量浓度黄嘌呤的添加对鼠伤寒沙门氏菌生长的影响结果如图4所示。由图4 可知，7 种物质均存在作为对照组时，细菌OD600值（0.2～0.23） 较仅有硫酸镁时细菌OD600值（0.35） 的情况下较低，当加入黄嘌呤时细菌OD600值均可达0.25 左右，组内方差分析表明，高浓度与中、低浓度存在差异（P<0.05），其中高浓度黄嘌呤培养的细菌OD600值可达0.3。结果分析表明，7 种物质存在的条件下，黄嘌呤可以促进细菌生长，且高浓度黄嘌呤效果较好。

图4 不同浓度的黄嘌呤对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 生长影响

高浓度黄嘌呤对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028生长曲线如图5 所示。由图5 可知，当培养4 h 后，加有黄嘌呤溶液与对照组在细菌浊度无明显差别，24 h 时黄嘌呤培养的细菌OD600值已达到0.3，对照组7 种物质培养的细菌OD600值达到0.2，两者存在差异（P<0.05）；48h 试验组OD600值有所上升；7种物质OD600值稍有下降。试验表明：培养48 h 后，7 种混合物质存在的情况下，高浓度黄嘌呤可以促进鼠伤寒沙门氏菌生长。

图5 高浓度黄嘌呤对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 生长曲线

2.3 8 种物质中有效成分筛选结果

在7 种物质基础上从39 种物质中筛选出可以促进沙门氏菌生长的黄嘌呤，结合以上结果，在促鼠伤寒沙门氏菌生长的8 种物质（甲硫氨酸、维生素C、胱氨酸二盐酸盐、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸镁、硫酸锰、黄嘌呤） 中，硫酸镁促进效果最佳，黄嘌呤在多种物质基础上发挥作用，故将硫酸镁、黄嘌呤与其余6 种物质配制成6 组混合溶液进行试验，探究硫酸镁、黄嘌呤、6 种物质的促生长作用。

进一步探究硫酸镁、黄嘌呤、6 种物质（甲硫氨酸、维生素C、胱氨酸二盐酸盐、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸锰） 中有效成分，配制溶液1（硫酸镁）、溶液2（硫酸镁+6 种物质）、溶液3（6 种物质）、溶液4（8 种物质）、溶液5（黄嘌呤）、溶液6（黄嘌呤+6 种物质） 进行试验，结果如图6 所示。

图6 不同混合溶液对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 生长影响

由图6 可知，与对照组相比，溶液2 培养的细菌OD600值存在差异（P<0.05）；与对照组相比，溶液1、溶液4 培养的细菌OD600值存在显著性差异（P<0.01）；溶液1、溶液4 以及溶液2 试验结果表明，硫酸镁单独存在时，促进细菌生长的效果最佳；八种物质也可促进细菌生长，效果次之；硫酸镁和6 种物质存在时，效果一般；进一步分析得出，硫酸镁存在时，细菌生长良好，缺乏硫酸镁时，细菌生长不佳，可见硫酸镁能有效促进细菌生长。

硫酸镁、黄嘌呤、6 种物质（甲硫氨酸、维生素C、胱氨酸二盐酸盐、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸锰） 配制的6 种混合溶液对鼠伤寒沙门氏菌的生长影响结果如图7 所示。

图7 有效成分对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 生长曲线

由图7 可知，当培养4 h 时，各种物质均生长且无明显差异；培养至24 h 时溶液1 细菌OD600值达0.35，溶液4 培养的细菌OD600值达0.3，溶液2培养的细菌OD600值达0.18；48 h 时细菌OD600值均有所上升。试验表明，硫酸镁在鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 生长过程中起到关键作用，硫酸镁在BPW 培养基中必不可少。

2.4 自制纯化学培养基与市售培养基对比

根据GB4789.28 中蛋白胨水培养基的标准要求进行研制，将50 mg/L 硫酸镁加入盐溶液中制成纯化学合成培养基S-BPW 1（硫酸镁）、S-BPW 2（七水硫酸镁），与市售培养基缓冲蛋白胨水培养基（BPW）、营养肉汤培养基（NB） 进行对比试验，葡萄糖盐溶液作为对照组，结果如图8 所示。

图8 自制纯化学培养基与市售培养基对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 生长影响比较

由图8 可知，S-BPW 1 和S-BPW 2 培养的细菌OD600 值均高于市售缓冲蛋白胨水培养基（BPW）、营养肉汤培养基（NB），2 组自制培养基与市售缓冲蛋白胨水培养基存在差异（P<0.05），自制纯化学合成缓冲蛋白胨水培养基在促进细菌生长方面已达到市售缓冲蛋白胨水培养基效果。

纯化学合成缓冲蛋白胨水培养基与市售培养基对比生长曲线如图9 所示。由图9 可知，培养4 h时各培养基无生长，培养24 h 后，市售缓冲蛋白胨水培养基（BPW）、营养肉汤培养基（NB）、自制纯化学培养基（S-BPW-1、S-BPW-2） 中细菌OD600值均达到0.35，48h 后市售缓冲蛋白胨水培养基（BPW）、营养肉汤培养基（NB）、自制纯化学培养基（S-BPW-1、S-BPW-2） 细菌OD600值均有所上升。结果表明，培养48 h 后自制纯化学培养基符合国标缓冲蛋白胨水培养基（BPW） 标准。

图9 自制纯化学培养基与市售培养基对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 生长曲线比较

无水硫酸镁与七水硫酸镁在细菌生长方面的差异如图10 所示。

图10 不同形式硫酸镁对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 生长影响

溶液1（硫酸镁） 与溶液7（七水硫酸镁）、溶液2（硫酸镁和6 种物质） 与溶液8（七水合硫酸镁和6 种物质） 培养的细菌OD600值无差异（P>0.05），溶液4（硫酸镁配制的八种混合物质）与溶液9（七水合硫酸镁配制的八种混合物质） 培养的细菌OD600值存在差异（P<0.05），硫酸镁单独培养的细菌OD600值最高，表明硫酸镁与七水合硫酸镁在细菌生长方面无差异。培养至24 h，两者培养的细菌OD600值达0.35，无明显差异；硫酸镁是否与水结合均对细菌生长无影响。试验中发现其他成分与硫酸镁混合后会影响细菌生长，6 种物质中哪种成分会降低硫酸镁对细菌生长影响还有待研究。

3 讨论与结论

本试验在纯化学培养基盐溶液的基础上添加氨基酸、维生素和无机盐，筛选出对沙门氏菌有促生长作用的有效成分，制成缓冲蛋白胨水（BPW） 纯化学合成培养基。成分：葡萄糖4 g/L、硫酸镁0.05 g/L、磷酸氢二钠6.78 g/L、磷酸二氢钾3.0 g/L、氯化钠0.5 g/L、氯化铵1.0 g/L，pH7.2±0.2。该培养基能提供沙门氏菌生长所需要的营养物质，培养24 h 的促生长能力与市售缓冲蛋白胨水培养基相当，且其成分精确，具有良好的可溯源性、稳定性和可重复性，质量可控，可以作为参比培养基，为我国BPW 培养基的生产与检定提供参考价值。

本试验前期研究发现甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸二盐酸盐、硫酸腺嘌呤、维生素C、硫酸锰6 种物质单独存在均可有效促进鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 生长，OD600值均可达到0.15～0.2，进一步筛选，在6 种物质和硫酸镁共同存在时，OD600值达到0.2，加入高浓度黄嘌呤后OD600值均可达到0.3。同样Mickelson 提出无乳链球菌在纯化学合成培养基生长离不开胱氨酸；C.Hong 用多种氨基酸制成纯化学合成培养基研究嗜热链球菌T1C2 不同生长阶段氨基酸消耗量以及必需量，表明半胱氨酸是嗜热链球菌T1C2 生长的必需氨基酸，占总需量的11%，半胱氨酸亦可促进鼠伤寒沙门氏菌生长。当黄嘌呤加入6 种物质和七水硫酸镁溶液中，对鼠伤寒沙门氏菌生长明显，与单独加入硫酸镁的培养基相当。Meng 指出细菌体内黄嘌呤经黄嘌呤脱氢酶催化最终生成尿酸，此过程可能与菌体生长的不同阶段有关。不同的细菌对不同物质敏感度存在差异，除硫酸镁以外，甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸二盐酸盐、硫酸腺嘌呤、维生素C、硫酸锰6 种物质均对鼠伤寒沙门氏菌的生长有不同程度促进作用。

值得注意的是，本试验中硫酸镁单独培养细菌时，OD600值为0.35，表明硫酸镁在细菌生长中起到关键作用。Rui 等利用微量呼吸测压法等技术探究硫酸镁对损伤菌修复的影响，发现硫酸镁对大肠杆菌，特别是损伤大肠杆菌有促进修复的作用。硫酸镁对不同细菌生长亦有促进作用，Tesh M J 发现七水硫酸镁在化学合成培养基中促进嗜肺军团菌生长，浓度在80 μmol/L 时效果最佳，同时也需要氯化钾的参与。硫酸镁对细菌生长具有较大影响，尤其在培养含氮物质及氨基酸缺乏时，细菌生长对硫酸镁的需求增加，且革兰氏阳性菌对硫酸镁需求较大。相关报道也指出硫酸镁是三磷酸腺苷（ATP）参与线粒体反应的辅助因子；镁离子是除钾离子外细胞含量最多的阳离子，镁离子会影响细胞膜离子通道；硫酸镁还参与其他酶活反应。

本试验用96 孔细胞培养基板进行细菌培养，培养基容量较小，筛选出的有效物质合成纯化学合成培养基后进行扩大体系试验，结果不佳，查阅相关文献，推测可能是新合成的纯化学培养基中关键物质对扩大体系敏感，相关问题有待进一步解决。本试验研究纯化学合成培养基配方，探寻检出沙门氏菌以及探究沙门氏菌最低生长限度的营养成分，可为我国食品安全抽检承检机构微生物检验工作提供参考。