ADRB1/2、NEDD4L基因多态性与急性失血人群自主神经调节功能的相关性

王 利 刘生敏 庄勤武 崔晓纯 刘 卫，

1.山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271016； 2.济宁医学院附属医院，山东 济宁 272000；3.联勤保障部队第九六〇医院(泰安院区)，山东 泰安 271000； 4.滨州医学院烟台附属医院，山东 烟台 264000

自主神经系统(autonomic nervous system，ANS)包括交感和副交感神经系统，血压稳定受交感和副交感神经双重调节，动脉压力感受器感受血压的变化，血压降低动脉压力感受器刺激性减弱，引起交感神经兴奋使血压升高。心率变异性(heart rate variability，HRV)指心脏连续搏动(R-R间期)之间的微小差异[1]，常用来定量描述自主神经功能，据报道HRV的改变与心血管功能调节蛋白的基因多态性相关[2-3]。肾上腺受体β1-AR和β2-AR是自主神经主要受体，β1-AR主要作用于心脏，通过心脏交感神经-肾上腺系统调节血压，冠脉、骨骼肌血管和平滑肌以β2-AR占优势，激动β2-AR可激活腺苷酸环化酶(AC)，使ATP转化为cAMP，引起血管平滑肌舒张，血压下降，代表交感神经的ADRB1(rs1801253)的G/C多态性和ADRB2(rs1042713)的G/A多态性是β1-AR和β2-AR常见的单核苷酸多态性，目前已有大量研究表明ADRB1(rs1801253)、ADRB2( rs1042713)位点基因多态性与高血压密切相关[4-6]，上皮钠通道通路(ENaC-NEDD4L-SGK1)是血压调节的关键通道[7]，受神经前体细胞表达发育调控蛋白NEDD4L的调控,通过ENac泛素化影响钠离子重吸收，NEDD4L(rs4149601)的 G/A基因多态性与高血压、体位性低血压显著相关[8-9]，据此推断ADRB1(rs1801253)、ADRB2(rs1042713)、NEDD4L(rs4149601)位点基因多态性都可能影响自主神经的调节功能。

以往研究表明献血350～400 mL以上会引起自主神经的显著变化，代表交感神经活性的LF增加，代表迷走神经活性的HF降低，这种自主神经主动的调节可维持进行性低血容量失血情况下的血压稳定[10-11]，但约1.6%的人由于迷走神经活性增强，易发生血管迷走神经反应[12-13]，与休克早期的表现相似。由此，本次实验以一次献血400 mL模拟急性失血，将进行性低血容量失血后反应与HRV分析结合起来，探讨在献血状态下，ADRB1(rs1801253)、ADRB2(rs1042713)和NEDD4L(rs414601)基因多态性与自主神经调节功能的相关性，也为急性失血时易发生休克人群的早期防治提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

以39名无偿献血400 mL青年志愿者为实验对象，年龄18～25(22±3.1)岁，体检无器质性病变者，排除引起自主神经功能紊乱的因素，无情绪障碍，未使用药物。实验对象一般资料见表1，除ADRB2携带突变等位基因人群与野生型心血管病家族史差异有统计学意义，其它差异无统计学意义。本实验及实施已通过伦理委员会批准，且均在观察对象签署知情同意基础上完成。

表1 实验对象基线情况比较

1.2 方法

1.2.1DNA提取与扩增 收集实验对象2 mL静脉血，HiPure Blood DNA Mini Kit提取DNA，参照各基因全序列用Primer 5.0软件设计引物，见表2。MJ PTC-100 PCR扩增ADRB1，ADRB2和NEDD4L基因相应片段。PCR反应总体积60 μL，2×Bench TopTM Tap Master Mix 30 μL，上游引物和下游引物各2.4 μL(10 u)，模板DNA 3 μL，加灭菌蒸馏水22.2～60 μL；反应条件为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR产物送北京华大基因采用Sanger测序法进行测序，测序结果用Chromas软件进行判读分析。

表2 各基因PCR引物序列

1.2.25 min心电信号采集 采用CB-1304-C动态心电记录仪(无锡中键科仪有限公司)，采集研究对象献血前后坐式体位、安静状态下5 min的心电信号，由CB系列心电血压回顾分析系统获取HRV时域和频域指标数值，采用的HRV指标见表3。

表3 HRV分析常用指标

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 基因型判定

经北京华大基因测序分析，研究人群中ADRB1( rs1801253)携带C等位基因者21例，其中突变型(C/C)6例，杂合型(G/C)15例，野生型(G/G)18例；ADRB2(rs1042713)携带A等位基因者30例，突变型(A/A)21例，杂合型(G/A)9例，野生型(G/G)9例；NEDD4L(rs4149601)携带A等位基因15例，突变型(A/A)3例，杂合型(G/A)12例，野生型(G/G)24例。ADRB1基因测序图谱见图1～3。

图1 ADRB1基因测序图谱

图2 ADRB2基因测序图谱

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验

对本次研究群体进行遗传平衡吻合度检验，结果表明ADRB1、ADRB2和NEDD4L基因基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，表明具有群体代表性。

2.3 基因多态性与献血前后HRV指标分析

ADRB1(rs1801253)、ADRB2(rs1042713)、NEDD4L(rs4149601)基因各位点野生型和突变基因携带者失血前后HRV指标见表4～7。献血前基础状态下，ADRB1(rs1801253)位点C等位基因携带者PNN50高于G/G型人群(P<0.05)，ADRB2(rs1042713)位点A等位基因携带者HF高于野生型，LF/HF低于G/G型人群(P<0.05)，NEDD4L(rs4149601)位点A等位基因携带者SDNN、PNN50、HF高于G/G型人群(P<0.05)；献血后A等位基因携带者不仅SDNN和HF，LF指标也高于G/G型人群(P<0.05)。献血前后，ADRB1(rs1801253)位点C等位基因携带者PNN50的增高幅度高于G/G型人群(P<0.05)，ADRB2(rs1042713)位点A等位基因携带者LF增高幅度大于G/G型人群(P<0.05)，NEDD4L(rs4149601)位点A等位基因携带者PNN50增高幅度显著低于G/G型人群(P<0.05)。

表4 ADRB1、ADRB2、NEDD4L基因多态性献血前HRV比较

表5 ADRB1、ADRB2、NEDD4L基因多态性献血后HRV比较

表6 ADRB1、ADRB2、NEDD4L基因多态性献血前后HRV改变幅度比较

3 讨 论

自主神经系统受到交感神经和迷走神经的双重调节，HRV反应了交感和迷走神经的活动及平衡关系，是目前评价自主神经功能最敏感的指标[14-16]，它包括时域(SDNN、PNN50)和频域(LF、HF、LF/HF)指标，能够反应交感和副交感神经张力的变化，PNN50及HF主要反应迷走神经活动，SDNN反应总的自主神经活动，LF反应交感神经活动，LF/HF反应交感/迷走神经平衡[17]。肾上腺受体是自主神经的主要受体，在调节交感神经活性上发挥重要作用。β-肾上腺受体(β-AR)基因多态性与血压的关系是近年来的研究热点，ADRB1(rs1801253)的G/C多态性和ADRB2(rs1042713)的G/A多态性是β1-AR和β2-AR常见的单核苷酸多态性，已有大量研究发现它们的多态性与血压相关。有研究表明NEDD4L(rs4149601)与体位性低血压相关，体位性低血压受自主神经的调节，因此，推测NEDD4L(rs4149601)是自主神经的相关基因。目前国内外尚未见有报道上述所有位点基因多态性与自主神经相关性的研究报道，本研究以一次献血400 mL刺激激活交感神经活性下，探究ADRB1(rs1801253)、ADRB2(rs1042713)、NEDD4L(rs4149601)位点基因多态性与自主神经调节功能的相关性。

本研究结果表明，ADRB1(rs1801253)位点C等位基因携带者HRV指标中PNN50高于(G/G)基因型人群，且献血前后PNN50的增高幅度也显著高于G/G基因型人群，这说明ADRB1(rs1801253)位点C等位基因携带者，献血后交感神经活动性减弱，迷走神经活性相对占优势，可能更易发生血管迷走神经反应。既往在一项针对亚洲人群的研究中也显示，ADRB1(rs1801253)携带C突变基因的人群更容易发生低血压[18]。献血前ADRB2(rs1042713)携带A突变基因人群HF高于(G/G)野生型人群，LF/HF则低于G/G基因型人群，献血后携带A突变基因人群LF虽高于G/G基因型人群，但LF/HF仍较低，虽然献血前后A突变基因携带者人群LF的增高幅度比较大，但总体上依然是A突变基因携带者迷走神经较G/G型人群占优势，以往也有研究发现ADRB2(rs1042713)携带A等位基因者LF显著降低[19-20]。献血前NEDD4L(rs4149601)A突变基因携带者SDNN、PNN50、HF显著高于G/G基因型人群，说明此时A突变基因携带者迷走神经活性较高，献血后A突变基因携带者不仅SDNN和HF，LF指标也显著高于G/G基因型人群，且献血前后A突变基因携带者PNN50的增高幅度显著低于G/G型人群，提示NEDD4L(rs4149601)A突变基因携带者对献血后反射性激活交感神经活性的反应性高。

本相关性研究结果显示，在一次献血400 mL状态下，上述研究的3个基因中ADRB1(rs1801253)位点C等位基因携带者与ADRB2(rs1042713)位点A等位基因携带者代表迷走神经活性的HRV指标显著增加，推测这些人群献血时更易发生血管迷走神经反应，而在失血性休克早期更易出现休克症状。而NEDD4L(rs4149601)位点A等位基因携带者NEDD4L(rs4149601)A突变基因携带者对献血后反射性激活交感神经活性的反应性高，推测A突变基因携带是失血性休克早期的保护因素。