水苏碱对异丙肾上腺素致小鼠心肌纤维化的保护作用

刘胜男 杨 丹 马宵雁 董毅璇 陈美华

山东第一医科大学(山东省医学科学院)药学院， 山东 泰安 271016

心肌纤维化(myocardialfibrosis，MF)是心脏成纤维细胞数量增加，心肌间质胶原过度沉积所致。心肌纤维化的主要病理变化是心肌的僵硬程度增加，心肌收缩及舒张能力下降，冠脉血供不足等。心肌纤维化破坏心脏功能，可促发充血性心力衰竭、恶性心律失常和猝死。MF常继发于冠心病、高血压等心血管疾病，也是心室重构发展难以逆转的重要原因，因此预防及控制心肌纤维化具有重要的临床意义[1]。传统中药益母草用于治疗月经不规律、痛经、闭经等妇科疾病[2]。近年来研究发现，益母草对人体其他系统疾病，特别是其生物碱(水苏碱)对心血管系统有一定的治疗和保护作用，同时其在抗炎、抗肿瘤、抗菌、止痛、止咳平喘等方面有药理活性，因而受到广泛的关注[3-4]。益母草提取物水苏碱在抗炎、抗氧化等方面效果显著，由此推测其可能对MF具有防治作用。为此本实验通过观察益母草提取物水苏碱(stachydrine)对异丙肾上腺素(isoproterenol，Iso)致小鼠MF模型的影响，并探讨水苏碱改善小鼠MF的药理学机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物

健康昆明种小鼠，18～22 g，雌雄兼用，山东第一医科大学(山东省医学科学院)实验动物中心提供，合格证号:SYXK( 鲁) 20190022；正常饮食饮水，光照12 h，明暗交替，实验处置符合动物伦理学标准。

1.2 药品、试剂

水苏碱(南京泽朗医药有限公司，纯度98%)；异丙肾上腺素(合肥巴斯夫生物科技有限公司，纯度99%)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、羟脯氨酸测定试剂盒(南京建成生物有限公司)；MASSON染液(南京建成生物有限公司)。

1.3 仪器

80-2型低速离心机，上海医疗器械集团公司;Bio-Rad680 酶标仪(美国伯乐公司)；RM2145 石蜡切片机(德国LEICA 公司)。

1.4 小鼠MF模型复制及实验分组、给药

小鼠50只，随机均分为对照组、模型组、水苏碱高剂量组、水苏碱中剂量组、水苏碱低剂量组(n=10)。除对照组外，其余各组每只小鼠皮下注射Iso 2.5 mg/kg，连续28 d，对照组按照2.5 mg/kg皮下注射等量生理盐水；同时，水苏碱高、中、低剂量组造模同时分别腹腔注射10.0、5.0、2.5 mg/kg的水苏碱，对照组、模型组腹腔注射等量生理盐水，连续28 d。

1.5 心重指数测定

实验结束后，小鼠称重，处死小鼠取心脏，称重，计算心重指数(HW/BW)。

1.6 生化指标检测

取心脏，匀浆，2 500 r/min，离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书严格操作，测定SOD活性、MDA含量和羟脯氨酸含量。

1.7 左心室组织病理学检查

取小鼠心尖组织，甲醛固定，石蜡包埋制成5 μm切片，分别进行HE及Masson染色，按照染色说明书严格操作，显微镜下观察心肌组织学的改变。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 心重指数的变化

与对照组相比，模型组小鼠心重指数明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；经水苏碱干预后，与模型组相比，水苏碱高、中剂量组心重指数明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠的心重指数

2.2 心肌组织SOD活性和MDA含量

与对照组比较，模型组小鼠心肌SOD活性明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而MDA含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；经水苏碱干预后，与模型组相比，水苏碱高、中剂量组小鼠心肌SOD活性明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，而MDA含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠心肌组织中SOD活性和MDA含量

2.3 心肌组织羟脯氨酸含量

与对照组相比，模型组小鼠心肌组织羟脯氨酸含量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；经水苏碱治疗后，与模型组相比，水苏碱高、中、低剂量组小鼠心肌组织羟脯氨酸含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 各组小鼠心肌组织羟脯氨酸含量的比较

2.4 心肌组织HE染色

对照组心肌组织排列整齐，间隙正常；模型组炎性细胞浸润，形态不规整，细胞边缘界限不分明，胞核深染；与模型组比较，水苏碱高、中、低剂量组炎性浸润程度均不同程度下降，细胞边缘界限分明，胞核较浅，坏死细胞减少。见图1。

A.对照组；B.模型组；C.水苏碱高剂量组；D.水苏碱中剂量组；E.水苏碱低剂量组。图1 各组小鼠心肌组织HE染色(×200)

2.5 心肌组织Masson染色

Masson染色显示心肌组织胶原纤维呈蓝紫色，心肌纤维呈红色。对照组心肌细胞形态正常，纤维排列致密整齐；模型组有大量胶原纤维沉积；水苏碱高、中、低剂量组虽仍有胶原沉积，但较模型组胶原沉积显著减少。见图2。

A.对照组；B.模型组；C.水苏碱高剂量组；D.水苏碱中剂量组；E.水苏碱低剂量组。图2 小鼠心肌组织Masson染色(×200)

3 讨 论

随着人口老龄化的进程，心脏病的发病率逐年增加，包括冠心病心肌梗死后的重塑、高血压性心肌肥厚、糖尿病性心脏病在内的许多种心脏病均存在不同程度的心肌纤维化，心肌纤维化是多种心血管疾病共同的病理基础。心肌纤维化主要以心肌纤维细胞异常增殖与细胞外基质(ECM)大量沉积为重要特点的病理改变，是心肌组织僵硬的结构基础，可以导致心室顺应性下降，影响心脏的正常收缩与舒张，并引发心律失常。心肌纤维化是多种常见心脏疾病向终末期心脏病发展的必然过程，是心功能由代偿向失代偿转变的关键。

心肌纤维化的病理生理学机制非常复杂，研究发现大量的氧自由基生成及过氧化反应异常增强是其主要机制之一[5-6]。SOD、MDA是目前公认的能较好反映体内氧自由基水平及脂质过氧化损伤程度的间接指标。SOD是机体清除自由基的重要酶类，心肌损伤时SOD的活性降低，机体超氧化物的生成大于清除，自由基产生与清除的平衡状态被破坏，大量自由基导致细胞线粒体功能障碍，细胞膜通透性增强，导致多种炎性反应及细胞调亡，进一步导致心肌纤维化。

我们的实验结果也显示，与对照组相比，模型组心重指数明显增加，羟脯氨酸含量明显增加,SOD活性显著性下降，MDA含量显著升高；显微镜下病理学显示炎性细胞浸润，出血坏死细胞增加，Masson染色显示大量胶原纤维沉积。同样说明心肌纤维化的病理学机制与氧化反应有关，可出现炎性反应和细胞凋亡。

现今医学对心肌纤维化没有确切的治疗手段，目前临床多用β肾上腺素受体阻断剂，血管紧张素转化酶抑制剂等缓解心肌纤维化，但疗效不佳且难以持久用药[7]。而中药干预能从多环节、多靶点发挥作用，具有一定的优势。益母草对妇产科疾病具有良好的治疗作用，其有效成分水苏碱具有与益母草传统功能相近的作用[8]，同时研究表明益母草水苏碱对心血管系统有一定的治疗和保护作用[8]。

本研究显示，水苏碱高、中、低剂量组与Iso模型组比较，心重指数明显减小，羟脯氨酸含量降低；Masson染色显示各剂量水苏碱给药组虽仍有胶原沉积，但较Iso模型组胶原沉积显著减少。表明水苏碱能有效地抑制模型小鼠的心肌肥厚。本实验证实水苏碱对Iso所致小鼠的心肌细胞纤维化程度、炎性浸润水平和细胞坏死方面均有改善，其保护机制可能与升高心肌组织SOD活性、降低MDA含量和有关。

既往我们对水苏碱对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用研究中发现水苏碱对四氯化碳所致小鼠肝损伤有保护作用，其机制与升高肝组织SOD活性、降低MDA含量高有关[9]。结合本次研究结果，水苏碱不但对肝组织的氧化损伤有保护作用，对心肌组织的氧化损伤同样有保护作用，两次研究结果显示其抗氧化作用与升高SOD活性和降低MDA含量有关。在我们的另外一项研究显示水苏碱对急性心肌缺血小鼠的心肌组织具有保护作用，其保护机制与降低急性心肌缺血小鼠血清血清乳酸脱氢酶、肌酸激酶活性和心肌髓过氧化物酶活性，提高心肌Na+-K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase活性有关[10]。与本次结果中水苏碱对心肌损伤起到保护作用相一致。由此我们推断水苏碱可能通过提高心肌组织SOD活性，加快超氧化物的清除，减少自由基数量，同时减低心肌组织MDA含量，减轻心肌组织氧化损伤和细胞凋亡，达到抑制心肌纤维化的效果。

综上所述，水苏碱能有效改善盐酸异丙肾上腺素诱发的小鼠心肌纤维化，其机制可能与提高心肌组织SOD活性、降低MDA含量有关。