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五味子醇甲对去甲肾上腺素诱导心肌肥大损伤的cT-I、cT-T、ET-1调控作用的影响

2020-09-25姜兴粲冯海鹏庞红红张景艳李建喜王学智

中国兽医学报 2020年8期
关键词:膜电位五味子心肌细胞

杨 敏,姜兴粲,冯海鹏,王 磊,张 康,庞红红,张景艳,张 凯,李建喜,王学智

(中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所 甘肃省中兽药工程技术研究中心,甘肃 兰州 730050)

五味子醇甲(schisandrin)主要来源于五味子(Schisandrachinensis(Turcz)Baill)果皮和成熟种皮,是五味子中分离得到的主要有效活性成分,具有抗炎抗氧化、镇静、抗惊厥、保护脑神经细胞、保肝、降血糖等多种药理活性作用[1-2]。已有研究在体外损伤的神经细胞、巨噬细胞等发现五味子醇甲具有抗炎抗氧化作用,可减少细胞凋亡[3-5]。但是,目前尚未见关于五味子醇甲在心肌肥大损伤中的抗炎抗氧化保护作用研究报道。

心肌肥大主要分为生理性和病理性肥大。生理性肥大可逆转,对机体无病态变化影响。病理性肥大主要是受到一些生物学信号(如去甲肾上腺素、血管紧张素Ⅱ和异丙肾上腺素等)刺激而作出的反应方式,通常与心肌血管形成受损,细胞外基质组成的不利变化和纤维化有关,持续性的心肌肥大,最终会发展形成心力衰竭等其他心血管疾病[6-7]。去甲肾上腺素(NE)作为诱导心肌细胞肥大模型被广泛应用,高剂量NE释放可导致心室肌细胞产生毒性作用,进而发生心肌肥大凋亡损伤[8-11]。研究表明,氧化应激和炎症反应与左心室肥大和心力衰竭发生发展有关[12]。而心肌肌钙蛋白T(CT-T)、心肌肌钙蛋白I(CT-I)和内皮素-1(ET-1)的水平变化与炎症反应密切相关,当CT-T、CT-I和ET-1表达上升,会促发炎症反应,产生氧化应激,增加心肌损伤[13-14]。那么通过测定心肌肥大损伤中ET-1、CT-I、CT-T的表达变化,有助于了解心肌肥大损伤的作用机理,揭示其在心力衰竭心肌损伤诊断中的价值。

因此,本试验为探讨五味子醇甲对去甲肾上腺素诱导心肌肥大损伤心肌细胞的保护作用,对心肌细胞表面积、存活率、凋亡率和线粒体膜电位的影响进行考察,并分析ET-1、cTnI、cTnT的表达变化,为防治心肌细胞肥大损伤研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及药物DMEM培养液均购自美国Gibco公司;MTT、5% BSA封闭液、4%组织细胞固定液均购自Solarbio公司;M-PER细胞裂解液购自美国Thermo Fisher Scientific公司;β-actin抗体购自美国Abcam公司;CT-I、CT-T、ET-1多克隆抗体购自美国Proteintech公司;山羊抗鼠和山羊抗兔多克隆抗体购自中杉金桥公司;Hoechst33342、线粒体膜电位检测试剂盒购自上海碧云天公司;Western blot显影液购自美国Advansta公司。

1.2 主要仪器CO2恒温培养箱购自广州安邦生物公司;全自动细胞计数仪购自美国 Nexcelom 公司;全波长酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司;光学显微镜、万能荧光倒置显微镜购自Olympus Corporation公司;LS55荧光分光光度计购自Perkin Elmer公司;激光共聚焦扫描显微镜购自卡尔蔡司股份公司。

1.3 心肌细胞的培养与传代大鼠源H9C2心肌细胞,购于中科院上海细胞库。制备含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM细胞完全培养液,37℃水浴融化冻存心肌细胞,完全融化后,立即加入DMEM细胞完全培养液,4℃、1 000 r/min离心5 min,弃上层液体,加入DMEM细胞完全培养液,接种至细胞培养瓶,37.5℃、5% CO2恒温培养24~48 h。显微镜观察细胞平铺量为90%以上,PBS洗涤3次弃去,0.25% 的胰蛋白酶37℃消化2 min,10% FBS的细胞培养液终止消化,接种于新的细胞培养瓶传代培养。

1.4 五味子醇甲作用损伤心肌细胞对细胞存活率的影响使用96孔板培养细胞,对照组每孔加入200 μL DMEM细胞完全培养液,模型组、卡托普利组、五味子醇甲低、中、高剂量组每孔加入等体积含10-6mol/L NE的DMEM完全培养液培养48 h,吸弃培养液,卡托普利组每孔加入200 μL含5 mg/L卡托普利的DMEM完全培养液,五味子醇甲低、中、高剂量组每孔分别加入等体积含5,10,20 mg/L五味子醇甲的DMEM完全细胞培养液,培养48 h,每组重复试验5次。避光配制5 g/L的MTT溶液,经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌,加药组、对照组每孔加入20 μL,37℃孵育4 h,彻底吸弃液体,每孔加入150 μL DMSO,低速振荡8 min,置于酶联免疫检测仪中,在吸收波长为490 nm时测定D值,取平均值计算细胞存活率。细胞存活率=(加药组吸光值-空白组吸光值)/(对照组吸光值-空白组吸光值)×100%。

1.5 五味子醇甲作用损伤心肌细胞对细胞凋亡率的影响接种心肌细胞于24孔板,每孔加入1 mL细胞密度为5×105/mL,按照1.4分组进行给药培养。PBS洗3次,每次3 min,4%细胞组织固定液固定20 min;PBS洗3次,每次3 min,每孔加入5 mg/L 的Hoechst33342染液,置于37℃孵育15 min;去液体,PBS洗3次,每次3 min。24 h内用荧光倒置显微镜观察细胞凋亡情况,并拍照记录。设置激发光为紫外光,物镜为20×,选取20个随机视野计数细胞凋亡数和细胞总数,计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=细胞凋亡数/细胞总数×100%。

1.6 HE染色及细胞肥大变化接种密度为1×105/mL的心肌细胞于6孔板细胞爬片上,细胞贴壁后,加入细胞培养液培养24~48 h。试验各组加药步骤同1.4,PBS洗涤3次,4%组织细胞固定液固定20 min;PBS洗涤3次,常温下自然风干;将爬片用中性树脂固定于载玻片上,细胞面朝上,苏木精染色1 min,自来水缓慢冲洗,盐酸酒精分化4 s,自来水洗涤,伊红染色3 min,自来水洗涤,自然晾干,中性树脂封片。光学显微镜下使用20×物镜进行拍照,图像处理软件使用NIH Image进行细胞大小(μm2)测量,每张切片选取10个视野,每组至少选取50个心肌细胞。

1.7 线粒体膜电位的检测96孔板培养H9C2心肌细胞,加药干预步骤同1.4,同时设置荧光阳性对照组:预先使用含10 μmol/L CCCP的细胞培养液在37℃条件下,处理心肌细胞20 min,PBS轻洗细胞。试验各组每孔细胞加入500 μL含血清的细胞培养液,每孔再入JC-1染色工作液500 μL,37℃温箱孵育20 min;吸弃上清液,使用JC-1染色缓冲液(1×)洗涤2次,激光共聚焦显微镜观察并拍照,荧光分光光度计测定荧光相对强度。

1.8 Western blot检测cTnI、cTnT、ET-1蛋白表达M-PER细胞裂解液裂解细胞,收集细胞蛋白裂解液,4℃、12 000 r/min离心10 min;收集上清液,与5×蛋白上样缓冲液混匀,沸水煮10 min。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,每孔蛋白上样量20 μL,甲醇活化PVDF膜10 s,半干转膜后,TBS洗涤3次,5% BSA封闭1 h;4℃分别孵育β-actin、ET-1、cTnI、cTnT抗体(稀释比例分别为1∶5 000,1∶250,1∶1 000,1∶500)过夜,TBST洗涤3次,加入含辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(稀释比2∶5 000)室温振荡孵育1 h;TBST洗涤3次,滴加ECL显影液至含目的蛋白的PVDF膜,放入显影仪显影,拍照记录,使用Image J图像软件分析结果。

2 结果

2.1 五味子醇甲作用损伤心肌细胞对细胞存活率的影响试验组与对照组(CON)比较,细胞存活率均具有统计学意义(P<0.05),卡托普利(CA)组和五味子醇甲高剂量(GH)组显著性降低(P<0.05),模型组(MOD)、五味子醇甲低剂量组(GL)和五味子醇甲中剂量组(GM)组则极显著性降低(P<0.01);CA组、GM组与MOD组对比,细胞存活率均显著性降低(P<0.05),GL组、GH组与MOD组比较,细胞存活率无统计学意义(P>0.05)(图1)。

图1 MTT法检测五味子醇甲保护心肌细胞损伤的细胞存活率变化 **.示与对照组对比,P<0.01;*.示与模型组对比,P<0.05;##.示与模型组对比,P<0.01;#.示与对照组对比,P<0.05;CON.对照组;MOD.模型组;CA.卡托普利组;GL.五味子醇甲低剂量组;GM.五味子醇甲中剂量组;GH.五味子醇甲高剂量组。下同

2.2 心肌细胞凋亡率的检测通过Hoechst33342染色观察五味子醇甲对损伤心肌细胞凋亡的影响(图2),正常细胞核呈现均匀的蓝色荧光,形状较为规则。凋亡细胞由于细胞膜被破坏,核内DNA的结构改变更易于结合Hoechest33342染料,而出现亮蓝色荧光,形状具有不规则形,染色质皱缩,蓝色团块出现碎裂。模型组(MOD)、卡托普利治疗组(CA)、低剂量治疗组(GL)、中剂量治疗组(GM)和高剂量治疗组(GH)与对照组(CON)比较细胞凋亡率均显著性升高(P<0.01);与MOD组对比,CA、GM、GH组细胞凋亡率极显著性降低(P<0.01),但GL组显著性降低(P<0.05)。

图2 Hochest 染色观察试验各组H9C2凋亡细胞核形态(A)与凋亡率(B) A.Hochest染色检测H9C2凋亡形态(200×,标尺:50 μm);B.组间H9C2细胞凋亡率比较

2.3 心肌细胞形态观察各试验组细胞形态变化如图3所示。对照组心肌细胞呈现长梭形,心肌细胞数量较多;模型组心肌细胞对比对照组出现肥大,并有不规则样形态出现;卡托普利阳性药物治疗后,心肌细胞对比模型组,肥大程度降低,细胞数目减少;五味子醇甲低、中、高剂量治疗组:心肌细胞数量明显比模型组多,且中、高剂量组细胞数量最多,而肥大心肌细胞形态变化的数量减少。

2.4 五味子醇甲对NE诱导的心肌细胞表面积变化的影响Image J系统软件测量分析结果所示,模型组、卡托普利治疗组、低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组细胞表面积均比对照组显著性增大(P>0.01),卡托普利治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组对比MOD组细胞表面积极显著性变小(P<0.01),但低剂量治疗组对比模型组细胞表面积减小不明显(P<0.05)(图4)。

2.5 线粒体膜电位变化如下图5所示,JC-1在CCCP荧光阳性对照组中绿色荧光明显较强,线粒体膜电位下降,对照组的红色荧光较强,线粒体膜电位上升。模型组红色荧光和绿色荧光叠加,绿色荧光明显增强;卡托普利药物组,红色荧光较强;五味子醇甲低、中、高剂量组红色荧光均强于绿色荧光,五味子醇甲中剂量组最为明显。红色荧光与绿色荧光的比值,表示荧光强度的相对值。CA、GM组与模型组对比,均具有统计学意义(P<0.05),相对比值升高,红色荧光强于绿色荧光,线粒体膜电位升高,细胞凋亡减少,但其他各组无统计学意义。

图3 心肌细胞HE染色形态图(200×) A.对照组;B.模型组;C.卡托普利治疗组;D.五味子醇甲低剂量组;E.五味子醇甲中剂量组;F.五味子醇甲高剂量组

图4 不同处理条件下各组心肌细胞表面积的变化

2.6 Western blot检测ET-1、cTnT 、cTnI蛋白表达各试验组ET-1、CT-T、CT-I蛋白表达结果如图6所示,MOD、CA、GL和GM组的ET-1蛋白相对表达量与CON组比较,极显著性升高(P<0.01),但GH组对比CON组显著性升高(P<0.05);GL、GM、GH组对比MOD组,均极显著性下调(P<0.01),但CA组显著性下调(P<0.05)。

3 讨论

五味子醇甲对去甲肾上腺素诱导的心肌细胞损伤具有保护作用,可降低细胞凋亡率,提高细胞存活率,并对肥大损伤的心肌细胞表面积具有改善作用。但是,随着五味子醇甲质量浓度的增高,会产生细胞毒性,损伤细胞。在五味子醇甲基本无细胞毒性时,对心肌细胞损伤的保护作用具有意义。五味子醇甲对去甲肾上腺素诱导的损伤心肌细胞的ET-1、CT-T和CT-I蛋白表达具有下调作用,随五味子醇甲浓度的升高,下调作用具有较明显变化。推测五味子醇甲通过下调ET-1、CT-T和CT-I蛋白表达,减低对心肌细胞的损伤,发挥抗炎抗氧化作用。

细胞中线粒体膜电位水平通常保持相对稳定,反映细胞正常的生理活动水平。单个细胞内线粒体膜电位发生异质变化,可能是病理变化的标志[15]。线粒体是心肌细胞能量的主要供应站,依赖于膜电位的稳定,外膜的通透性改变,使线粒体膜电位发生变化[16]。当线粒体膜电位降低,是线粒体发生损伤的重要标志[17]。线粒体膜电位改变与线粒体膜通透性孔道(mPTP)相关,当mPTP开放时,膜电位降低,反之升高[18]。本试验结果表明,10 mg/L的五味子醇甲有助于线粒体膜电位的恢复,抑制mPTP通道开放,保护线粒体,减少心肌细胞损伤。

内皮素-1(ET-1)是一种缩血管物质,可促进细胞生长,增强有丝分裂功能,是引起众多疾病的炎症因子。ET-1对心血管疾病起主要作用,当ET-1升高可使心肌细胞发生肥大,其发生、发展与心力衰竭疾病的预后密切相关[19]。心肌肌钙蛋白(cTn)是心肌收缩的调节蛋白,依据心肌肌钙蛋白的I、T亚单位,主要分为CT-I、CT-T,其释放入血液循环是心肌损伤的高灵敏和高特异性的标志,常被用于诊断慢性心力衰竭疾病。有大量证据证明心肌肌钙蛋白(cTn)是评判心脏毒性和心肌损伤的首选,也被作为人类心脏损伤的金标准[20]。炎症反应和氧化应激均能导致肌钙蛋白上升。本试验研究中ET-1相对表达水平在卡托普利和五味子醇甲的分别作用下,均有明显下降,阳性药物卡托普利与五味子醇甲作用效果相似,可在一定程度上下调ET-1表达,降低心肌细胞的肥大损伤。五味子醇甲不同浓度的作用均有下调CT-T蛋白相对表达,五味子醇甲高剂量20 mg/L能明显降低CT-T表达量;对于CT-I蛋白的相对表达,卡托普利组与五味子醇甲中、高剂量组对比模型组均有显著性降低,五味子醇甲低剂量组却显著性升高,提示5 mg/L的五味子醇甲低剂量组可能有助于上调CT-I表达,而随剂量增加又可下调CT-I表达。

图5 各试验组心肌细胞线粒体膜电位变化 A.不同组H9C2线粒体膜电位的荧光显微镜成像红色荧光与绿色荧光叠加图(400×,标尺:25 μm);B.红色荧光与绿色荧光的比值

图6 各试验组心肌细胞ET-1、CT-T、CT-I蛋白的表达量变化 A.各试验组中β-actin、ET-1、CT-T、CT-I蛋白表达的条带图;B,C,D.分别为ET-1、CT-T、CT-I蛋白的表达量统计结果

综上所述,五味子醇甲作用于10-6mol/L去甲肾上腺素诱导的损伤心肌细胞,可降低细胞凋亡率,提高细胞存活率,改善细胞形态,可能通过下调ET-1、CT-T、CT-I表达,发挥五味子醇甲抗炎和抗氧化作用,减少心肌细胞损伤。

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