河北地区蛋鸡源大肠杆菌分子分群、耐药性及生物被膜检测与分析

张召兴，李佩国，张海龙，李蕴玉，张香斋，贾青辉，张建文

(1.河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛066600；2.河北旅游职业学院 畜牧兽医系，河北 承德 067000)

鸡大肠杆菌病是由不同血清型的致病性大肠杆菌所引起的一种局部或全身感染的急性或慢性传染病。主要表现为急性败血症、肝周炎、心包炎、气囊炎、卵黄腹膜炎等临床症状。该病可以通过呼吸道、消化道、卵等多种途径传播，可以感染不同日龄的鸡，其发病率和死亡率均较高，是临床中常见的细菌性传染病之一[1-2]。临床中鸡大肠杆菌常与支原体等病原混合感染，继发其他疾病，对蛋鸡养殖的危害很大[3]。鸡大肠杆菌拥有多种致病性血清型，不同血清型的菌株无交叉免疫保护性，目前没有有效的疫苗对该病进行预防[4]。抗生素在临床中的不合理使用，导致大肠杆菌的耐药性及多重耐药性十分严重，因此合理使用抗生素，减少其耐药性产生十分有必要[5]。细菌生物被膜(biofilm，BF)由附着细菌细胞和包裹细菌的水合性胞外聚合物物质组成，BF是组成结构性细菌群落的主要物质，在成熟的外界条件下细菌均能够形成BF，BF形成被认为是细菌适应恶劣环境而形成的一种自我保护模式，BF形成能力与细菌毒力、耐药性具有一定相关性[6-7]。国内关于蛋鸡源大肠杆菌耐药性与BF形成能力相关性的报道相对较少。因此，本试验以河北地区临床分离的120株蛋鸡源大肠杆菌分离株为研究对象，对其系统进化分群、耐药性及生物被膜形成能力进行检测，分析其相关性,为临床中合理用药及防控该病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株试验用120株大肠杆菌为2018-2019年在河北省秦皇岛、唐山、承德、邢台等地区不同养殖场不同的疑似患大肠杆菌的蛋鸡体内中分离得到的临床分离株；大肠杆菌质控菌株ATCC25922由河北省预防兽医学重点实验室提供。

1.2 主要试剂与仪器大肠杆菌显色培养基、营养肉汤均购自青岛高科园海博生物技术有限公司；96孔细菌培养板购自石家庄丰悦生物科技有限公司；2×Taq Marker Mix购自北京康为世纪生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker购自北京中科瑞泰生物公司；临床中常用药物药敏纸片购自杭州天和微生物制剂有限公司；结晶紫分析纯AR 指示剂由本实验室提供；高速小型离心机、梯度PCR仪均购自德国Eppendorf公司；凝胶成像系统由美国伯乐公司生产。

1.3 细菌的复苏与扩大培养取出-80℃保存的临床分离的120株蛋鸡源大肠杆菌的菌种，室温解冻，接种划线于大肠杆菌显色培养基，37℃恒温培养12～18 h，挑取大肠杆菌显色培养基生长的单个菌落，接种于营养肉汤中37℃振荡培养，进行菌落计数。

1.4 细菌系统进化分群PCR鉴定参考文献[7]设计大肠杆菌系统进化分群引物chuA、yiaA和TspE4.C2(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成，用水煮法提取分离菌株的基因组DNA用三重PCR法对分离菌株进行系统进化分群鉴定。根据大肠杆菌分离菌株的chuA、yiaA和TspE4.C2基因携带情况，参照文献[8]中系统进化分群鉴定示图，判定其分离菌株系统进化群情况(图1)。

表1 大肠杆菌系统进化分群引物序列

1.5 细菌的耐药性检测用K-B 药敏纸片法对分离到的120株大肠杆菌分离株进行药敏试验，并以大肠杆菌 ATCC25922 作为质控菌株，参照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的药敏试验操作方法和标准进行试验结果判断[9]。

1.6 细菌的BF形成能力检测参考文献[10]，采用结晶紫微孔板法对河北地区临床分离到的120株蛋鸡源大肠杆菌分离株进行BF形成能力测定。判定标准:以阴性对照孔D值的2倍作为判断能否形成BF的临界点Dc，当D≤Dc 时，表示BF形成 能力为零；当Dc

1.7 数据相关性分析采用统计学软件SPSS19.0，分析河北地区分离的120株大肠杆菌耐药性与BF形成能力表型之间的相关性，计算其符合率。

2 结果

2.1 细菌系统进化分群结果河北地区临床分离到的120株蛋鸡源大肠杆菌分离株能扩增出chuA、yiaA和TspE4.C2目的基因的条带(图1)。经结果判定分析，分离的120株大肠杆菌中，A群9株，占分离菌株的7.5%；B1群24株，占分离菌株的20%；B2群64株，占分离菌株的53.3%；D群23株，占分离菌株的27.5%；A+B1 群33株，占分离菌株的27.5%；B2+D 群，87株，占分离菌株的72.5%(表2)。

2.2 细菌的耐药性检测由表2可知，河北地区分离的120株大肠杆菌对氨苄西林、阿莫西林、头孢曲松、多西环素、林可霉素、磺胺间甲氧嘧啶、恩诺沙星、环丙沙星8种药物耐药率为45.8%～93.3%；对头孢噻呋、庆大霉素、链霉素、大观霉素、氟苯尼考、替米考星6种药物耐药率为15.0%～43.3%； B2+D群的大肠杆菌分离株对氨苄西林、阿莫西林、头孢曲松、头孢噻呋、大观霉素、多西环素、氟苯尼考、替米考星、林可霉素、磺胺间甲氧嘧啶、恩诺沙星、环丙沙星的耐药率均高于A+B1群大肠杆的耐药率，A+B1群大肠杆分离株对庆大霉素、链霉素的耐药率高于B2+D群大肠杆菌分离株的耐药率。

图1 大肠杆菌部分分离菌株系统进化分群PCR鉴定结果 M.DL2000 DNA Marker; 1～14.分离菌株;15.空白对照

表2 大肠杆菌分离株耐药性及系统进化分群相关性分析结果 %

2.3 BF形成能力检测结果由表3可知，河北地区分离的120株大肠杆菌中111株能形成BF，占分离菌株的92.5%(111/120)。其中，强形成膜能力菌株有58株、中形成膜能力菌株有29株、弱形成膜能力菌株有24株、不形成BF菌株的有9株，分别占分离菌株的48.3%，24.3%，20.0%和7.5%；BF形成能力强的多属于B2群和D群大肠杆菌分离株，分别占各群的50.0%和82.6%，BF形成能力中的多属于B2群和D群大肠杆菌分离株，分别占各群的26.6%和26.1%，BF形成能力弱的多属于A1群和B1群大肠杆菌分离株，分别占各群的44.4%和45.8%。

表3 大肠杆菌分离株BF形成能力及系统进化分群相关性分析结果 %

2.4 BF形成能力与耐药性相关性分析由表4可知，BF形成能力与耐药性相关性分析结果显示，分离的120株大肠杆菌BF形成能力与阿莫西林、头孢曲松、头孢噻呋、链霉素、大观霉素、多西环素、氟苯尼考、林可霉素、磺胺间甲氧嘧啶、恩诺沙星10种抗生素的耐药性符合率为91.5%～96.1%，分离的120株大肠杆菌BF形成能力与环丙沙星、庆大霉素、替米考星、氨苄西林4种生素的耐药性符合率为73.7%～89.3%。

3 讨论

大肠杆菌病在鸡养殖中常见且多发，可以引起急性败血症、气囊炎、肝周炎、心包炎、肠炎、卵黄腹膜炎等一系列的病症，能引起不同日龄的鸡发病，尤其对雏鸡和产蛋鸡危害较严重，给养鸡业造成重大经济损失[3-4]。本试验从2018-2019年秦皇岛、唐山、承德、邢台等河北地区不同鸡养殖场中，采集急性死亡、腹泻的雏鸡、卵黄腹膜炎产蛋鸡等疑似患大肠杆菌病病料组织，进行大肠杆菌分离鉴定。对分离的大肠杆菌人工感染1日龄的雏鸡验证其致病性，分离得到120株大肠杆菌临床分离株。因此，对秦皇岛、唐山、承德、邢台等河北地区分离的蛋鸡源大肠杆菌进行分子分群、耐药性及生物被膜形成能力等主要生物学特性鉴定，并分析其相关性。

鸡大肠杆菌分离菌株可以依据种系发育群、生物表型、抗原特性等属性进行区分其分子分群、血清型、生物膜等生物学特性[2-4]。国内外相关研究表明，大肠杆菌系统进化分群可分为A、B1、B2和D共4个群，其中B2和D群被认为是主要的致病群，肠外致病性大肠杆菌多属于B2群和D群，A群和B1群多属于肠内和共生型大肠杆菌[7,11-12]。JOSE等[11]报道，人尿路感染感染的大肠杆菌51%属于B2群，20%属于D群，均高于A群和B1群。WANG等[12]报道，肠外大肠杆菌感染的病例中以B2群流行为主，B2群的大肠杆菌的毒力高于其他群的分离菌株。本试验结果表明，分离到的120株大肠杆菌中A群9株(7.5%)、B1群24株(20%)、B2群64株(53.3%)、D群23株(27.5%)，以B2+D 群流行为主，与ZHU等[13]报道的禽致病性大肠杆菌B2群为主基本一致，因而说明了B2+D群大肠杆菌对蛋鸡具有潜在的危害。

大肠杆菌具有易产生耐药性的特点，其耐药性的产生不仅与抗菌药物使用有关，还与耐药机制有关，其耐药性可以通过质粒在不同菌株之间传播，引起多重耐药菌株不断的产生[3-5]。本试验结果表明，120株大肠杆菌对氨苄西林、阿莫西林、头孢曲松等8种药物的耐药率为45.8%～93.3%，与其他药物的耐药率为15.0%～43.3%，说明分离到的蛋鸡源大肠杆菌耐药性很严重。贾青辉等[14]报道，2013-2016年河北地区分离到的104株蛋鸡源大肠杆菌对20种抗菌药物呈现出多重耐药性，其中耐11～14种抗生素最多。于静晨等[2]报道，江苏、安徽等地分离到的53株禽致病性大肠杆菌对环丙沙星、氨苄西林、多西环素的耐药率较高。余蕊等[15]报道，江苏省扬州地区的禽源大肠杆菌对临床上常用的抗生素耐药性都较高。这些试验结果表明，鸡源大肠杆菌耐药性现象很普遍，由于不同地区大肠菌株的临床用药及遗传特性的差异，导致其耐药性及耐药种类有所差异。本试验结果表明，B2+D群大肠杆菌分离株对氨苄西林、阿莫西林、头孢曲松等12种药物的耐药率均高于A+B1群，且耐药性与系统进化分群存在一定相关性。与李金朋等[7]报道具有一定的差异性，这可能与其感染的宿主(猪)及地区有关。

BF的形成可增强细菌对外界抗菌药物的抵抗能力，大肠杆菌BF的形成能力与其耐药性具有一定相关性[16]。李金朋等[7]报道，BF形成能增加大肠杆菌的耐药性。夏琦琦等[10]报道，水貂肠道致病性大肠杆菌BF形成能力与耐药性之间具有相关性。本试验结果表明，120株大肠杆菌BF形成能力与14种抗生素耐药性的符合率在73.7%以上，说明大肠杆菌的BF形成能力与其产生的耐药性有关，但BF形成能力增强细菌耐药性的机理尚未明确，有待进一步研究。本试验对河北地区的蛋鸡大肠杆菌分子分群、耐药性及BF形成能力进行研究分析，为了解河北地区蛋鸡大肠杆菌的主要生物学特性及防控提供试验依据。