硫氢化钠对脊髓小脑共济失调3型小鼠海马MBP及学习记忆的影响*

姜洪波，董家行，秦玉飞，刘佳聪，姜万举，李若男，刘岚慈，田一丹，许予明，杜爱林，Δ

(1. 新乡医学院第三附属医院，河南 新乡 453000； 2. 新乡医学院生理学与神经生物学教研室，中英脑功能损伤联合实验室，河南省高校脑研究重点实验室培育基地，河南 新乡 453000； 3. 郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052)

SCA3(spinocerebellar ataxia type3，脊髓小脑共济失调3型)是累及人类神经系统的主要遗传退行性疾病之一，是常染色体显性遗传性脊髓小脑共济失调最常见亚型，在中国的患病率约为3～5/10万，主要临床表现为进行性加重的小脑性共济失调、步态不稳、动作笨拙，可伴有眼球震颤，吞咽障碍以及感觉异常等[1]，研究表明：记忆力、认知力降低与中枢神经系统(central nervous system，CNS)有髓神经纤维髓鞘结构的改变有着密切的联系。CNS髓鞘的主要成分之一髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)能够维持CNS髓鞘结构和功能的稳定、维持脑发育[2]，且髓鞘内MBP的正常表达依赖于线粒体的正常能量供应。研究表明，在SCA3发病机制中线粒体损伤也发挥重要作用[3]，线粒体损伤会导致少突胶质细胞ATP合成障碍，并进一步导致MBP的降低及髓鞘损伤。

H2S具有调节神经内分泌功能和抗神经毒性的作用，并通过减轻氧化损伤、上调自噬和维持蛋白稳态等来保证神经系统的正常功能[4]。研究表明H2S能拮抗血管性痴呆患者海马神经元的凋亡过程[5]。此外，H2S对学习和记忆也有重要的调节作用[6]，能够促进神经细胞再生、保护线粒体[7]。因此推测通过改变SCA3小鼠海马内硫化氢的含量很可能改善其线粒体功能，进而使MBP含量增加来减轻海马髓鞘损伤，并进一步改善SCA3小鼠的学习记忆障碍[8]。本实验通过比较SCA3小鼠和野生型(Wild Type，WT)小鼠的学习记忆功能、海马内硫化氢含量和MBP的表达差异，探讨不同浓度的外源性硫氢化钠对SCA3的干预机制。

1 材料与方法

1.1 动物及SCA3小鼠的鉴定

雄性SCA3转基因小鼠和雄性野生型小鼠(wild type，WT)均来源于郑州大学实验动物中心，体重20～23 g，月龄12个月。SCA3小鼠的鉴定引物共3对，共用上游引物，下游引物有三条，选择其中之一即可，其中引物SCA3-Ide-F / SCA3-Ide-R1较稳定。若为SCA3转基因小鼠，则在选用引物SCA3-Ide-R1鉴定时，会扩增储500 bp大小的特异性片段，若为野生型正常小鼠则扩增不出特异片段(表1)。

Tab. 1 Primers for identification of SCA 3 mice

1.2 模型建立

将60只12月龄雄性小鼠进行分组，12只WT小鼠组每日腹腔注射等量生理盐水做为正常对照组(NC Group)，48只SCA3小鼠随机分为模型组(M Group)，NaHS低剂量组(NL Group，NaHS 10 μmol/kg)、NaHS中剂量组(NM Group，NaHS 50 μmol/kg)和NaHS高剂量组(NH Group，NaHS 100 μmol/kg)。实验持续28 d，期间每周监测小鼠的体重，并根据小鼠体重的改变相应调整给药量。

1.3 水迷宫测试

1.3.1 定位航行实验 游泳池水温调整至22～24℃再开始实验。把无毒的白色涂料加入到水池内，目的是使水变得不透明，水下平台低至水面下0.5 cm。Morris水迷宫初筛是实验前从所有实验动物中筛选出会游泳且游泳速度、反应时间合适的小鼠。定位航行实验共进行4 d，每天改变游泳小鼠的开始象限，改变方向为逆时针。具体步骤参考杜爱林[9]等的研究。

1.3.2 空间探索实验 为检测小鼠在空间记忆形成后的定位保持能力，于定位航行实验结束24 h后进行一次空间探索实验。具体步骤参考杜爱林[10]等的研究。

1.4 标本的固定取材和制作部分

每组随机挑选8只小鼠，用4%多聚甲醛经左心室灌注后完整取出其脑组织，并及时进行固定，脱水，石蜡包埋等步骤，制成石蜡切片，用于免疫组化实验。剩余小鼠处死后完整取出其脑组织，并分离出双侧海马，均放入液氮保存，用于海马的硫化氢含量的测定和电镜观察。

1.5 测定小鼠海马组织H2S含量

用全自动酶标仪在波长670 nm测定吸光度，同时使用分光光度法间接测定海马中H2S含量。具体实验步骤参照倪云成[10]等的研究。

1.6 测小鼠海马区域MBP的表达情况

取制备好的石蜡切片，进行抗原修复和免疫组化，DAB显色，显微镜观察并摄片。用image-pro-plus 6.0 图像处理软件对MBP的阳性表达情况进行分析，统计数据并判断MBP的阳性表达情况。具体实验步骤参照徐磊[11]等的研究。

1.7 电镜观察小鼠海马

取小鼠海马组织，体积约1 mm3，取材后在1 min内用4%戊二醛固定，进行脱水包埋切片染色，电镜观测并摄片，观察海马神经元髓鞘超微结构。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 SCA3小鼠的鉴定

我们通过聚合酶链反应来鉴定SCA3小鼠基因型，SCA3小鼠在500 bp片段左右会出现特异性的扩增，而这个片段在野生型小鼠中没有扩增。图中显示样品具有500 bp片段，因此样本1、4、5和6来源于SCA3小鼠，而样本2和3则来源于野生型小鼠(图1)。

Fig. 1 Analysis of PCR products of SCA3-Ide-R1 amplified from mice

2.2 Morris水迷宫

2.2.1 NaHS对游行距离的影响 4 d的Morris水迷宫训练试验数据如表2所示，12月龄模型组(M)SCA3小鼠的平均行驶距离较同龄对照组(NC)的WT小鼠明显延长(P<0.05)，这表明SCA3小鼠的学习记忆存在一定障碍，也证明SCA3模型小鼠造模成功；而经过不同剂量NaHS治疗后(低、中、高剂量)的12月龄小鼠与模型组(M)SCA3小鼠相比，平均行驶距离有不同程度的缩短，均有统计学意义(P<0.05)。这提示外源性的NaHS能够改善SCA3小鼠的学习记忆能力。

2.2.2 NaHS对平台潜伏期的影响 Morris水迷宫平均平台潜伏期结果显示，12月龄的模型组(M)SCA3小鼠较同龄对照组(NC)WT小鼠明显延长(P<0.05)；而经过外源性的NaHS治疗后，与模型组SCA3小鼠相比，NaHS各剂量组(低、中、高剂量)小鼠的平均平台潜伏期明显缩短(P<0.05)，再次证明NaHS能显著改善SCA3小鼠学习记忆能力。

2.2.3 NaHS对游泳速度的影响 水迷宫的游泳速度数据显示，12月龄的对照组(NC)WT小鼠组和SCA3小鼠之间无统计学差异(P>0.05)，同样12月龄NaHS组小鼠(低、中、高剂量)和模型组(M)SCA3小鼠间也无统计学差异(P>0.05，表2)。

Tab. 2 The distance, latency and swimming velocity of mice in n=12)

2.3 各组小鼠海马H2S含量及有髓神经纤维MBP的表达

结果如表3所示，与正常对照组(NC)相比，模型组(M)SCA3小鼠海马区域H2S含量明显降低(P<0.01)；在给予NaHS干预后，NaHS低剂量小鼠组(NL)与模型组(M)SCA3小鼠比较，海马组织H2S浓度虽然升高，但是无统计学差异(P>0.05)；而NaHS中剂量组(NM)和NaHS高剂量组(NH)小鼠与模型组(M)SCA3小鼠比较，海马组织H2S含量均显著增加(P均<0.01)。

模型组(M)SCA3小鼠与正常对照组(NC)相比，海马有髓神经纤维MBP平均光密度明显降低，丝状着色减少(P<0.05)；在给予NaHS干预后，NaHS低、中、高剂量组小鼠(NL、NM和NH)与模型组(M)SCA3小鼠比较，海马有髓神经纤维MBP平均光密度均升高，丝状着色增加(P<0.05，图2) 。

Tab. 3 The contents of H2S and MBP in the SCA3 mice with NaHS n=8)

Fig. 2 MBP mean optical density of hippocampal myelinated nerve fibers

2.4 各组小鼠海马轴突髓鞘的变化

正常对照组(NC)小鼠海马轴突被厚厚的髓鞘包绕，髓鞘板层致密，完整，且边界清晰(图3)；而模型组SCA3小鼠的海马髓鞘板层排列松散，紊乱，轴索出现间隙；提示SCA3小鼠的神经元髓鞘很可能存在一定的损伤；而经不同浓度的NaHS干预后，海马轴突髓鞘版层松散逐渐减少，分布趋向规则。

Fig. 3 Electron microscopy of hippocampal myelin

3 讨论

SCA3是一种神经退行性疾病，患者有不同程度的认知功能障碍[12]，目前尚无良好的治疗方法。H2S是一种新型的调节因子和信号传递分子，在神经系统、心血管系统中发挥重要调节作用，被称为继CO和NO后的第三种气体信号分子[13]。 H2S具有多种生理功能，包括调节学习与记忆、降低组织与细胞有氧氧化水平、激活血管平滑肌KATP通道造成血管舒张等[14]。并且能通过下丘脑-垂体-肾上腺轴来参与神经内分泌功能的调节[15]，保护机体理化环境稳定，还具有抗神经毒性作用，保证神经系统功能的正常。在机体生理浓度范围内，H2S作为CNS一种重要的神经调质，可以通过调节环磷腺苷(cAMP)的水平提高神经元N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体调节的反应，易化海马长时程增强(long-term potentiation，LTP)的产生，对学习、记忆发挥重要的调节功能[16]并且有研究表明生理浓度的H2S通过激活线粒体KATP改善线粒体的呼吸功能、提高膜电位、增加能量的产生;抑制Ca2+超载对线粒体起到保护作用[16]。在中枢神经系统中，MBP是由少突胶质细胞合成，是组成髓鞘的主要成分之一，因此常被作为特异性生化指标来判断有无髓鞘的脱失[17]，有研究表明：中枢神经系统有髓神经纤维髓鞘结构的改变与认知、记忆功能降低存在密切的关系[18]。所以通过调节海马内H2S水平改变MBP含量可能作为治疗SCA3发病时记忆力障碍的一种思路。

本实验中分别测定各组小鼠学习记忆能力、海马内H2S、有髓神经纤维MBP的含量以及电镜观察海马髓鞘结构。据Morris水迷宫结果显示，SCA3小鼠的学习记忆能力明显低于正常野生型小鼠，经过NaHS治疗后，SCA3小鼠的学习记忆能力得到一定改善。通过免疫组化的方法测出SCA3小鼠的大脑海马内有髓神经纤维通路的MBP含量明显低于WT小鼠，说明海马内有髓神经纤维的MBP含量与SCA3小鼠生长过程中的空间学习和记忆有关[19]，经过NaHS治疗后，MBP平均光密度升高，丝状着色增加，含量升高。H2S含量测定结果显示与正常野生型小鼠对比，SCA3模型组小鼠脑内的H2S含量明显低于WT小鼠，经过NaHS治疗后，海马组织H2S含量显著增加。通过电镜拍摄海马神经元发现，与正常对照组小鼠相比，SCA3小鼠的海马髓鞘板层排列松散，紊乱，轴索出现间隙，提示SCA3小鼠的神经元髓鞘很可能存在一定的损伤，然而经过NaHS治疗后，SCA3小鼠脑内的H2S含量显著提升到正常水平附近，髓鞘板层结构也有明显的改善。

研究结果表明SCA3小鼠记忆功能障碍可能是由于其海马内有髓神经纤维通路MBP含量的降低引起的，H2S对小鼠学习记忆能力的改善也是通过上调海马内有髓神经纤维通路MBP的含量。然而，这项实验只研究小鼠SCA3模型的12月龄的学习和记忆发展和H2S关系，仍需要研究不同月龄SCA3小鼠海马内H2S含量与学习和记忆关系以及详细的神经回路，包括其效应及H2S对SCA3的学习和记忆的影响。

综上所述，硫氢化钠治疗SCA3小鼠的机制可能是硫氢化钠作为H2S的前体物质，通过上调海马内H2S的含量，使海马有髓神经纤维通路MBP含量增加来减轻其髓鞘损伤，从而改善SCA3小鼠的学习记忆障碍。外源性硫氢化钠可能会改变SCA3患者海马的营养状态，而这将为临床SCA3患者的营养支持与治疗提供新的方向。