NB-UVB对白癜风患者黑素细胞生物学特性的影响

袁相凤 罗增香 刘相明 孟慧娟 李建娜 刘国艳

潍坊医学院附属医院皮肤科，潍坊，261013

白癜风是一种常见的后天性色素脱失性皮肤病，其发病机制尚不清楚，目前认为可能与环境、遗传、自身免疫、氧化应激、神经精神等因素有关。该病的主要临床表现为皮肤和毛囊的泛发性或局限性白斑[1]。白癜风可在任何年龄阶段起病，但多见于青壮年，无明显的性别差异与种族差异。一般人群的患病率在0.1%～2.7%[2]，影响容貌美观，易诊而难治。黑素细胞是一类起源于外胚层的神经嵴的特定黑素生成细胞，发育成熟的黑素细胞对于有脊椎生物的眼睛、毛发、皮肤等部位的色素呈现至关重要，引起白癜风的直接原因是黑素细胞所生成的黑素过少或缺乏[3]。有学者认为，白癜风患者皮损处的黑素细胞并未完全消失，并且仍可检测到酪氨酸酶活性残留,因此激活残留的黑素细胞并促进其增殖,提高黑素的合成水平是现今治疗白癜风的重要方向[4]。研究证明，UVB照射能够促进患者皮损区产生色素，以窄谱UVB(NB-UVB)效果最为显著，特别适合应用于泛发型白癜风的治疗。在白癜风患者接受NB-UVB治疗后,通常表现为典型的以毛囊自中心向外逐渐扩展的点状型复色方式过程，有学者据此现象认为可能是与存在于毛囊部的某种黑素细胞库被激活有关[5]，但是具体的作用机制及相关作用条件尚不清楚。因此在本研究中，我们选取了34例白癜风患者对其皮损处黑素细胞进行体外培养并进行NB-UVB的辐射研究，旨在探讨NB-UVB治疗白癜风患者的具体机制，为临床调整治疗方案提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 培养基Medium254(Cascade公司，美国)；胎牛血清FBS、二甲基亚砜DMSO、四甲基偶氮唑蓝MTT、胰蛋白酶(Sigma公司，美国)；倒置显微镜(OLYMPUS，美国)；BIOBASE-EL10C 酶标仪(欧莱博科学仪器公司，中国)；台式NB-UVB辐射仪(Waldmann公司，德国)。

1.2 体外细胞培养 选取2015年2月至2018年4月在我院接受治疗的34例白癜风患者皮损处黑素细胞进行体外培养。采用负压吸疱法获取患者皮损处的表皮组织。取得标本后立即置于含100 μg/mL链霉素、100 U/mL青霉素的磷酸盐缓冲液中进行处理，分别剪成2 mm×2 mm后挑出加入0.25%的胰蛋白酶在37℃恒温箱中消化30 min以去除表皮，之后加入10%体积的FBS终止，吹打成单细胞悬液后进行5 min×1000 r/min离心，去上清，再向其中加入Medium254培养基，震荡摇匀，接种于培养瓶中，置入5% CO2、37℃条件的孵箱中培养，换液间隔为48～72 h，培养至80%融合状态后操作传代，所有黑素细胞需利用HMB-45免疫组化染色进行鉴定。

1.3 NB-UVB辐射 利用6孔板将传至4代的黑素细胞进行浓度调整，为2×105/mL，当培养到80%的融合状态后，吸去培养液，加入磷酸盐缓冲液，用功率为4.5 mW/cm2的台式NB-UVB辐射仪采用分别不同的辐射剂量(0、20、40、60、80、100 mJ/cm2)对细胞进行辐照[6]。辐射后弃去磷酸盐缓冲液，重新加入Medium254继续培养，保证所有培养板与光源距离均为10 cm。

1.4 黑素细胞增殖活性测定 选取辐射后分别处于2d、3d、4d三个时间点的细胞置于96孔板中，每孔100 μL。提前4 h向每孔加入20 μL 浓度为5 g/L的MTT，4 h结束后吸去上清液,每孔加入150 μL DMSO，置于摇床上缓慢振荡15 min直到结晶被完全溶解,利用酶标仪测定将96孔板中每个样品在490 nm处的光吸收值(A值)[7]。

1.5 黑素细胞黑素量测定 选取辐射后分别处于2 d、3 d、4 d三个时间点的细胞，吸去培养液后利用磷酸盐缓冲液进行，1 min×2次。收集细胞后先作超声处理再离心，5 min×1000 r/min，弃掉上清，沉淀利用10%乙醇和三氯乙酸进行洗涤，之后再次离心，5 min×1000 r/min。将处理完毕后的样品转移至96孔板中，100 μL/孔。每孔加入1N含油10%DMSO的NaOH，80℃水浴2 h后，利用酶标仪测490 nm各孔的光吸收值[8]。

1.6 自噬相关蛋白测定 选取辐射后处于1 d的细胞，常规提取蛋白并进行定量。之后进行凝胶电泳，转膜采用硝酸纤维素膜。成功后先利用5%脱脂牛奶进行封闭，室温×1 h。再分别加入鼠抗P62抗体、鼠抗p-AMPK、兔抗p-mTOR、兔抗LC3抗体，4℃×12 h。孵育结束后利用TBST液洗膜 3次×10 min。在每一个样品上加入辣根过氧化物酶标记的山羊二抗IgG，室温×1 h。TBST液洗膜 3次×10 min。最后得到的目的条带用ImageJ软件计算灰度值。

2 结果

2.1 处理后1 d自噬相关蛋白水平变化 在实验剂量下，NB-UVB处理后1 d LC3 II/I、p-AMPK表达水平均明显上调(P<0.05)，而p-mTOR、P26的表达水平均明显下降(P<0.05)，见表1。

表1 处理后1d自噬相关蛋白水平变化

2.2 NB-UVB对黑素细胞增殖活性的影响 实验剂量下，NB-UVB辐射后可明显促进黑素细胞增殖(P<0.05)，其中辐射后3 d、4 d时受辐射黑素细胞的增殖率均明显高于2 d，但辐射4 d与3 d相比无明显差异(P>0.05)。≥40 mJ/cm2的剂量可明显对黑素细胞的增殖产生抑制作用，使细胞处于负增长状态(表2)。

表2 NB-UVB对黑素细胞增殖活性的影响

2.3 NB-UVB对黑素细胞合成黑素能力的影响 实验剂量下，NB-UVB辐射后可明显提高黑素细胞合成黑素的能力(P<0.05)，其中辐射3 d、4 d的黑素细胞的合成能力明显大于2 d(P<0.05)，但前两者之间无明显差异(P>0.05)，见表3。

表3 NB-UVB对黑素细胞合成黑素能力的影响

3 讨论

在皮肤病光疗中，紫外线的波长选择具有重要意义。临床中最常用的是长波紫外线(UVA)和中波紫外线(UVB)，其中UVB生物学活性最强，波长为290～320 nm。其中310 nm左右的紫外线治疗效果最好，因此将滤除其他波长后所产生波长为311 nm左右的紫外线做为窄谱中波紫外线(NB-UVB)，它具有强烈的单一性，能够轻易穿过真皮层从而避免在释放能量的同时灼伤皮肤，因此在皮肤病的治疗中得到了广泛应用。

近年来在白癜风发病机制的相关研究中，自噬学说占有重要地位。由于自噬缺陷的黑素细胞存在不同程度的氧化还原平衡失常，从而导致其余正常黑素细胞受到破坏，最终引起黑素细胞脱失产生白癜风。既往研究报道，适宜剂量的UVB照射对人皮肤成纤维细胞以及HaCaT细胞的自噬起到促进作用。聂慧琼等[9]的研究也报道了接受UVB辐射的表皮细胞中自噬反应的增强。P62是参与选择性自噬过程的主要蛋白，能够衔接自噬囊泡与泛素化蛋白，并将泛素化蛋白转运至自噬体中讲解，因此细胞的自噬强度通常与P62的表达水平成反比，P62蓄积意味着细胞存在自噬缺陷[10]。而在文献中自噬的活化程度通常以LC3 I转化为LC3 II的水平作为表示，LC3是自噬的标志性蛋白[11]。mTOR是调控细胞增殖和生长的中枢因子,AMPK则是一种关键的生理能量传感器，mTOR/AMPK信号途径与机体调控自噬的过程有着密切联系[12]。王敏等[13]认为通过活化AMPK，抑制mTOR蛋白转录，可以调节UVB辐射所致角质形成细胞自噬水平。我们的研究显示, 在实验剂量下，NB-UVB处理后1d p-AMPK表达水平明显上调，p-mTOR的表达水平明显下降(P<0.05)，进一步研究显示LC3 II/I显著升高，P62蛋白水平下降(P<0.05)，与上述文献一致。

虽然目前NB-UVB的临床疗效已明确，但是具体治疗方案仍然存在一定争议，因此本次研究还对NB-UVB的治疗间隔进行了探索。Uitentuis等[7]选择3次/周的NB-UVB辐射方案对白癜风患者进行治疗，在12个月的疗程后复色有效率高达92%。雷杰豪等[14]选择2次/周的NB-UVB辐射方案对白癜风患者进行治疗，在12个月的疗程后复色有效率为82.5%，而相同实验条件下3次/周的方案复色有效率为90.3%，由此提出NB-UVB 的最佳治疗方案为3次/周。由于NB-UVB治疗是一个较为长期的过程，长时间受辐射可能会增加患者光致癌或光老化的风险[15]，在选择治疗方案时需要综合考虑临床疗效以及治疗安全性，特别是警惕皮肤鳞癌的发生，这就要求在保证治疗效果的前提下尽可能控制辐射频率。我们的研究提示，NB-UVB对黑素细胞增殖的诱导作用呈现剂量依赖式递减效应，对黑素细胞合成黑素能力的提高作用呈现剂量依赖式递增效应。因此，我们初步认为NB-UVB治疗白癜风的方案以间隔3～4 d(2次/周)为最佳，与每周照射3次相比，不仅可以保证治疗效果，还可以提高治疗的安全性、减轻患者的经济负担。

本次研究尚存在一定局限性，主要是观察时间相对较短，下一步我们将进行持久的大样本观察，同时结合临床随访研究获得更为科学有效的证据。综上所述，NB-UVB能够有效调节白癜风患者黑素细胞自噬相关蛋白表达水平，活化自噬信号通路，同时对黑素细胞增殖活性存在先促进后抑制的作用，而对黑素合成量存在促进作用，这体现了 NB-UVB对黑素细胞生物学特性影响作用的复杂性，在体内可能还与更为广泛的细胞因子等调节因素相关，尚需要进一步动物实验进行探索，以明确其可能的治疗机制。