正五聚蛋白3促进软骨细胞MMP13产生从而加重骨性关节炎

樊凯 张海严 蔡道章

南方医科大学第三附属医院（广州510360）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是最常见的关节炎形式，主要累及膝和（或）髋关节；OA的发生与多种因素有关，包括年龄、性别、肥胖等[1]。其病理改变主要有关节软骨的破坏、软骨下骨的硬化、骨赘的形成、滑膜炎症和韧带的降解等，共同导致受累关节的疼痛和功能障碍[2]。但最近研究表明，在关节软骨破坏的早期就有滑膜炎的存在，并导致患OA 风险的增加[3]。急性、亚急性及慢性损伤导致最初关节软骨的破坏，软骨降解产物诱发了滑膜的局部炎症反应，后者促进软骨的进一步破坏，形成恶性循环[4]。故关节内炎症的存在是促进OA 软骨损伤及维持OA 病程进展的重要原因[5]。

正五聚蛋白3（PTX3）是一种急性炎症蛋白，该蛋白质与血清淀粉阳蛋白质A和C反应蛋白同属于一个蛋白家族，PTX3是主要由中性粒细胞、树突样细胞等分泌[6]。它在炎症反应中扮演着重要的作用，比如微生物的感染、动脉粥样硬化等，可激活补体等方式对激素和炎症进行调节[7]。在一些急性感染性疾病中，PTX3和CRP 可作为血液中的标志物来对其进行监测，在一定程度上可直接反应血管炎症的状态[8]。以上说明PTX3 可以参与到炎症反应中，且扮演着重要的作用；有大量临床研究表明，关节炎患者的血液中和滑膜液中的PTX3的含量显著提高[9]，但国内外未有相关的文献报道，PTX3 对骨性关节炎发生发展的影响。故本文对PTX3在骨性关节炎中的相互作用做探索，探究相互之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器IL-1β（美国Peprotech）；抗PTX3克隆抗体（美国Peprotech）；抗基质金属蛋白酶-13抗体（美国abcam）；抗Ⅱ型胶原抗体（美国abcam）；DAB 显色剂（中国中杉金桥）；番红O 粉末（美国Sigma）；固绿染剂（美国Sigma）；苏木素粉剂（美国Sigma）；伊红粉剂（美国Sigma）；石蜡包埋机（德国Leicarm）；石蜡切片机（德国Leicarm）；光学显微镜（德国Zeiss）；超速离心机（中国Legendmicro）。

1.1.2 人源膝关节软骨标本膝骨关节炎与类风湿关节炎软骨标本来自全膝关节置换的患者（n=5）。五年内患有恶性肿瘤、糖尿病以及其他一些严重慢性病的患者不在选择之内，本研究中所筛选的膝骨关节炎均因退行性骨关节病变引起。所有样本均取自南方医科大学第三附属医院骨科。

1.2 方法

1.2.1 佐剂诱导性关节炎（adjuvant induced arthritis，AIA）模型的建立10只C57/BL6 雄性小鼠，体质量（20.0±1.7）g，年龄（8.0±0.7）周，雄性小鼠均购自南方医科大学实验动物中心。随机分为实验组和对照组，每组各5只，其中实验组进行AIA 建模，而对照组则进行假手术。实验组小鼠第0天，将完全弗氏佐剂皮下注射到小鼠的内侧腋窝中。两周后膝关节中注射不完全弗氏佐剂。这种关节炎模型被广泛用作小鼠类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的模型。术后6周后处死小鼠收集标本。

1.2.2 内侧半月板失稳（destabilization of the medial meniscus，DMM）骨关节炎模型的建立DMM实验组（n=5）和NC 假手术组（n=5）。其中实验组麻醉小鼠固定其右膝关节，切开皮肤、膝关节囊，进行内侧半月板离断手术后缝合。术后肌肉注射青霉素防止感染。而NC组为假手术组不进行内侧半月板离断手术，仅剖开关节囊后逐层缝合，其余操作相同。

1.2.3 免疫组织化学染色、甲苯胺蓝染色和苏木素＆伊红（HE）染色（1）免疫组织化学：常规脱蜡水，双氧水处理15 min 修复后，封闭血清1 h，再用一抗4℃孵育过夜。第二天用二抗37℃孵育1 h后显色。（2）甲苯胺蓝（Toluidine blue，TB）染色：常规脱蜡水化，甲苯胺蓝染液染后洗涤，随后晾干透明树脂封片，在显微镜下观察染色情况。（3）苏木素＆伊红（HE）染色：常规脱蜡水化，苏木素染色冲洗，分化液分化；再用伊红染色，随后晾干透明封片。

1.2.4 细胞培养软骨前细胞系ATDC5（日本Tsukuba）在DMEM/F12（美国Gibco）中用10%FBS（美国Gibco），在37℃，5%CO2下维持。用IL-1β（美国Sigma）处理细胞24 h 以模拟体外OA。

1.2.5 细胞转染实验siRNA oligo 基因序列分别是：sense（5′-3′）GCACAAAGAGGAAUCCAUATT；antisense（5′-3′）UAUGGAUUCCUCUUUGUGCTT，分四组，分别为NC组、IL-1β组、IL-1β+siCon组和IL-1β+siPTX3组。IL-1β+siCon组和IL-1β+siPTX3组分别加入siCon和siPTX3的溶液2 μL，并加入含Lipofectamine 2000 基础培养基，4 h后换液，然后后三组加入10 ng/mL IL-1β，NC组则加入等量的培养基。

1.2.6 蛋白印迹实验（Western blot）使用RIPA裂解细胞中提取蛋白质。将样品上样到电泳凝胶孔中进行电泳和转膜。转膜完后，将膜在封液中封闭。再与一抗4℃孵育过夜。次日，用二抗在37℃下孵育2 h后进行曝光。

1.3 统计学方法应用SPSS 19.0 统计软件分析，实验结果以均数±标准差表示，采用方差分析分析对各组数据进行方差齐性分析，并通过独立样本t检验分别对各组实验结果进行统计学分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床软骨标本PTX3、MMP13的表达OA患者软骨切片HE染色和甲苯胺蓝（TB）染色显示透明软骨细胞减少，厚度变薄，表面粗糙，纤维化有破损；RA患者软骨切片HE染色软骨水肿，软骨组织绒毛状部分纤维化；免疫组化结果显示OA组与RA组的软骨中PTX3的表达较NC组增多（P＜0.001），同样在OA组与RA组中MMP13表达较NC组上调（P＜0.000 1）。见图1。

2.2 疾病模型小鼠中PTX3、MMP13的表达免疫组化结果显示，相对于NC组，PTX3蛋白在DMM组关节软骨面中的表达相对于NC组明显升高（P＜0.000 1）。在DMM 软骨层中MMP13蛋白表达较NC组和AIA组亦增多（P＜0.001）。见图2。

图1 NC组、OA组与RA组的PTX3、MMP13的表达Fig.1 Expression of PTX3 and MMP13 in NC，OA and RA group

2.3 IL-1β诱导细胞后COL2、MMP13、PTX3的表达IL-1β诱导软骨细胞ADTC5 24 h后，发现软骨细胞的COL2蛋白表达减少（P＜0.01），MMP13蛋白表达上调（P＜0.001），且PTX3蛋白也随之上调（P＜0.000 1）。而在48 h组中发现软骨细胞的COL2蛋白表达减少更为明显（P＜0.001），且MMP13蛋白与PTX3蛋白表达进一步增多（P＜0.000 1）。见图3。

图2 NC组、DMM组与AIA组的PTX3、MMP13的表达Fig.2 Expression of PTX3 and MMP13 in NC,DMM and AIA group

2.4 干扰PTX3表达后细胞合成与降解指标的表达转染干扰PTX3的表达，在此基础上用IL-1β诱导建立OA细胞模型，干扰PTX3后发现，IL+siPTX3组的COL2的表达较IL+siNC组增多且差异有统计学意义（P＜0.05），并且IL+siPTX3组MMP13的表达有所减少（P＜0.05）。见图4。

图3 IL-1β诱导细胞后COL2、MMP13、PTX3的表达Fig.3 Expression of COL2、MMP13 and PTX3 in ADTC5 cells treated with IL-1β

图4 ADTC5 细胞经转染处理后的COL2，MMP13 and PTX3表达Fig.4 Expressions of COL2，MMP13 and PTX3 of ADTC5 cells after cell transfection

3 讨论

目前骨性关节炎的发病原因与机制均尚未明确，临床上亦无有效的预防和非手术根治的方法，对于晚期的OA患者，唯有通过关节置换术给与治疗以矫正畸形、恢复关节活动度和缓解疼痛[10]。随着中国老龄化的加重，OA患者也逐年增多，而骨性关节炎以高致残率为典型特点，给社会造成巨大的经济压力同时，在面对单纯手术选择时且患者带来沉重的心理负担[11-12]。

PTX3是一种比较常见的急性炎性蛋白，在感染、炎症和肿瘤等方面具有重要的作用[13-14]，例如当组织受到损伤或感染时，通过激活补体等方式对激素和炎症进行调节，从而对因炎症损伤的组织进行修复[15]。在低度炎症的环境中，如肥胖，衰老等状态时，正五聚蛋白3 往往表现出升高趋势[16-17]，侧面说明该蛋白在促进炎症的发生中起到了重要的作用。

本研究结果显示，PTX3在关节炎组织的软组织中具有高表达性，这也表明了PTX3 可能与OA的发展具有密切的关系；利用IL-1β诱导ADTC5的细胞模型上，检测PTX3 与相关合成分解代谢指标COL2、MMP13，验证PTX3在软骨细胞中的表达；通过使用小干扰siRNA 敲减经由IL-1β 诱导的ADTC5 细胞上的PTX3蛋白表达，发现其分解指标MMP13蛋白表达减少，COL2表达增多。实验结果表明，干扰PTX3 基因可减少细胞基质金属蛋白酶的生成，从而减慢软骨基质的退变。

以上说明，PTX3 可能在OA的发生发展中，起到了一定的促进作用，可将PTX3 作为OA的潜在治疗靶点，为OA 病理发生发展机制的研究以及OA的临床预防和治疗提供全新的理论依据。