橡胶树树皮总蛋白的提取方法比较①

梁 群 程 汉黄华孙③

(1海南大学热带农林学院 海南海口570228;2中国热带农业科学院橡胶研究所 海南海口571101)

巴西橡胶树是大戟科橡胶树属植物，是天然 橡胶的最主要来源。橡胶树树皮组织中的乳管细胞作为橡胶树中合成和贮存橡胶的重要组织，一直是研究的重点［1］。橡胶合成有赖于韧皮部中蔗糖等碳源的代谢和运输及乳管细胞中各种酶的合成反应；此外，橡胶树寒害［2］、割面干涸（Tap‐ping panel dryness，TPD）［3］等生理综合反应都会涉及各种蛋白质的表达和功能。树皮蛋白的成功提取是研究其表达和功能的前提。然而迄今尚未见有较成熟的橡胶树树皮蛋白质提取方法的报道。

在过去的几十年里，已有多种植物蛋白样品制备方法得到应用，诸如丙酮沉淀法、TCA/丙酮沉淀法、苯酚提取法、TCA/丙酮-酚提取法、Trizol沉淀法、尿素-硫脲提取法等［4］。但是由于橡胶树树皮结构复杂，木栓化严重，次生代谢产物丰富，蛋白含量低且杂质含量高，使高质量的蛋白样品制备比较困难，至今尚未有橡胶树树皮中蛋白提取的标准方法。王斌等［5］使用改进酚抽法提取巴西橡胶树木质部的蛋白，过程复杂且步骤繁琐；袁坤等［6］使用尿素提取液提取方法无法成功获得高丰度蛋白；谷瑞升等［7］比较了4种木本植物蛋白的提取方法，发现改良丙酮沉降法对木本植物叶片、悬浮细胞以及花药蛋白提取有效。本研究以橡胶树成熟大树的树干树皮，为材料，比较TCA/丙酮沉淀法（方法1）、TCA/丙酮—双乙法（方法2）、TCA/丙酮-Tris-HCl法（方法3）3种橡胶树树皮中总蛋白质的提取方法，并对其进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

所用材料为10年生未开割的巴西橡胶树RRIM 600，采自海南省儋州国家橡胶树种质资源圃，以树干木栓化的树皮为材料，剥取后的树皮经液氮速冻后，迅速置于–80℃冰箱备用。

1.1.2 主要试剂

丙酮、三氯乙酸、盐酸、无水乙醇、乙醚、考马斯亮蓝G-250等，购自广州化学试剂厂；尿素、硫脲、二硫苏糖醇、苯甲基磺酰氟、三羟甲基氨基甲烷、聚乙烯吡咯烷酮、30%丙烯酰胺（29∶1）Acr/Bis、10% AP，购自北京索莱宝科技有限公司；蛋白定量试剂盒Bradford Protein Assay Kit，购自康维世纪生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器

研磨机为德国IKA分析研磨机-All basic，离心机为Thermo Scientific的HERAEUS Multifuge X1R，METTLER Toledo DELTA 320 pH计，真空干燥机CentriVap Concentrator LABCONCO，超声波破碎机，MULTISCAN GO酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 橡胶树树皮总蛋白提取

TCA/丙酮沉淀法：参照Sarawanan等［8］的方法，在此方法基础上稍作改进。称取一定量的树皮置于液氮预冷过的研钵中，加入0.5%（m/m）PVPP防止研磨过程中氧化，反复加入液氮研磨至粉末；在研磨后的样品中加入等体积的10%的TCA-丙酮溶液悬浮、0.1 mol/L PMSF、1 mol/L DTT至其终浓度分别为1 mmol/L、10 mmol/L，于-20℃静置6 h或过夜后，以4℃、20 000 g离心15 min，弃上清；沉淀用等体积的预冷的丙酮溶液重悬浮（加入20 mmol/L DTT），于-20℃静置1 h后，以4℃、20 000 g离心15 min，弃上清，用丙酮再重复洗2次直至没有颜色；取出沉淀真空干燥约5 min，除尽有机溶剂；按照10 mg干粉末加入200滋L尿素裂解液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS）的比例，再加入1 mmol/L PMSF、10 mmol/L DTT，超声5 min，充分溶解1 h后，以4℃，35 000 g离心30 min，上清为所需的蛋白溶液。

TCA/丙酮—双乙法：与TCA/丙酮沉淀法相比，在用TCA/丙酮清洗树皮粉末3次并离心后，加入双乙试剂（V乙醇∶V乙醚＝1∶1），于-20℃静置1 h后，以4℃，20 000 g离心15 min，弃上清；再加入丙酮重复洗2次直至没有颜色。后续操作均与TCA/丙酮沉淀法相同。

TCA/丙酮-Tris-HCl法：按TCA/丙酮沉淀法的操作进行至真空干燥获得树皮干粉后，用Tris-HCl（120 mmol/L Tris-HCl、20%甘油、4% SDS）溶液代替尿素裂解液溶解树皮粉末，其他操作均与TCA/丙酮沉淀法相同。

1.2.2 蛋白定量

使用康为世纪生物科技有限公司的Bradford Protein Assay Kit测量蛋白质浓度，以试剂盒中的牛血清蛋白（BSA）为标准蛋白质制作标准曲线；取待测样品1滋L于试剂盒中的考马斯亮蓝G-250显色液中，使用MULTISCAN GO酶标仪测其OD595值，蛋白质浓度表示为mg/mL，重复3次以评估蛋白质提取效率。

1.2.3 SDS-PAGE与Western blot

制作2块SDS-PAGE胶，分离胶和浓缩胶的浓度分别是10%和5%；将上述3种方法提取的蛋白母液用SDS-PAGE上样缓冲液稀释，在100℃下煮沸5 min后迅速置于冰上，待其冷却后加入孔中，50 V起始电压，待样品进入分离胶后将电压升到100 V；电泳完毕后将其中一块胶进行考马斯亮蓝R-250染色，另一块胶进行western blot实验，具体实验步骤参考abcam官网［9］的方法。

2 结果与分析

2.1 三种橡胶树树皮总蛋白提取方法比较

采用的3种橡胶树树皮蛋白提取方法，在传统的丙酮/TCA法的基础上稍加改进。橡胶树树皮经过液氮研磨后，加入TCA/丙酮匀浆，经过离心、真空干燥等步骤得到树皮干粉；随后加入尿素裂解液、双乙试剂和Tris-HCl提取液溶解，经过超声波助溶破碎离心，得到树皮总蛋白的粗提液（图1）。由于传统的提取方法最后的蛋白溶解时间过长，容易造成蛋白质降解，因此改进方法中主要优化了提取液配方，以防止蛋白质降解。TCA/丙酮-双乙法是先使用双乙试剂（V乙醇∶V乙醚＝1∶1）清洗残留丙酮，用尿素裂解液溶解提取；TCA/丙酮-Tris-HCl法采用Tris-HCl提取液（120 mmol/L Tris-HCl、20%甘油、4%SDS）。

图1三种蛋白质提取方案的示意图

2.2 三种总蛋白提取方法的提取效率比较

使用3种提取方案对蛋白质提取物进行定量比较，发现不同提取方法获得的蛋白质质量有所差异。TCA/丙酮沉淀法耗时最少，且Western blot结果清晰，无杂带，但总蛋白电泳可见的条带数目最少，蛋白浓度偏低。TCA/丙酮—双乙法耗时最多，可见条带数目比TCA/丙酮要多，蛋白浓度相差不大。TCA/丙酮-Tris-HCl法耗时较少，提取蛋白的浓度最高达到3.21 mg/mL，SDS-PAGE电泳的条带清晰，上样孔干净，泳道无拖尾，条带数量最多。综合来看，TCA/丙酮-Tris-HCl提取的蛋白质量较好（表1）。

表1三种橡胶树树皮总蛋白提取方法的提取效果比较

2.3 三种总蛋白提取方法的电泳结果

将3种方法提取的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，上样量均为100滋g。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色与脱色，结果如图2所示。TCA/丙酮法（泳道1）和TCA/丙酮—双乙法（泳道2）提取的蛋白经过电泳后，泳道背景较深，加样孔中有残留杂质，泳道拖尾严重，主带难以区分，说明这2种方法提取的总蛋白中含有较多的杂质。TCA/丙酮-Tris-HCl法（泳道3）提取的蛋白经过电泳后，泳道背景最淡，加样孔干净无残留，蛋白条带清晰可见。使用Gel Image Analysis软件分析胶图可知，方法1检测条带数目为8条，方法2检测条带数目为11条，方法3检测条带数目为22条。表明TCA/丙酮-Tris-HCl法提取的橡胶树树皮总蛋白凝胶电泳效果最好。

图2不同提取方法提取橡胶树树皮总蛋白的单向电泳图

2.4 三种蛋白提取方法的Western blot分析

将提取的蛋白质经SDS-PAGE电泳后，转膜至PVDF膜，经过Western blot分析后的结果如图3所示。使用Western blot对橡胶树树皮中微管蛋白tubulin进行定量分析可知，图谱背景清晰，蛋白条带清晰且位置大小正确。在使用相同上样量的情况下，TCA/丙酮-Tris-HCl法的条带更亮，常规TCA/丙酮沉淀法和TCA/丙酮—双乙法的条带较弱。推测原因可能是样品杂质较高导致这2种方法提取的蛋白量偏高。

图3 3种蛋白提取方法提取橡胶树树皮tubulin蛋白定量

3 讨论

橡胶树树皮蛋白提取过程复杂，且研磨困难。本研究为了得到充分研磨好的树皮粉末，首先使用剪刀剪碎树皮，然后使用研磨机研磨树皮，操作时间过长，因此可能会导致蛋白质降解。因此，后续的提取方法中，在抑制蛋白降解方面要有所改进。

常规TCA/丙酮提取法耗时少且容易操作，一般作为植物蛋白提取的初始方案，是目前提取植物蛋白的常用方法之一，具有降低次生代谢物质干扰、减少蛋白降解等优点，但该方法常用于幼嫩组织中蛋白的提取，不适用于更为复杂的植物组织［10］；该方法的一个最大缺点是蛋白质很难重新溶解，而且样品中的非蛋白成分很难除去，可能会丢失膜蛋白和疏水性蛋白［11］。用乙醇—乙醚洗涤以除去水溶性杂质（包括高浓度的盐离子），比传统的TCA/丙酮法方法能更有效地排除杂质干扰；TCA丙酮-Tris-HCl法的提取效果明显比前2个方法更好，主要表现在蛋白条带的数目以及条带的清晰度，而且Tris-HC1法操作简便，时间较短，成本适中，提取步骤简单，减少了因处理步骤繁多而造成的蛋白质损失，大大提高了试验结果的重复性［10］。

巴西橡胶树作为一种重要的产胶作物，其主要经济价值均存在于树皮中的乳管细胞。开展乳管及树皮内重要蛋白质功能研究对于后续进行橡胶合成及代谢调控研究至关重要。本研究通过比较3种橡胶树树皮蛋白质提取方法，提出了一种简单高效的橡胶树树皮蛋白提取方法，为进一步开展橡胶树树皮内重要蛋白功能研究提供了参考。