咖啡与茶远缘嫁接接合部组织形态解剖学研究①

彭文书曾胤刘聪龚婉莹严亮季爱兵③

(1滇西应用技术大学普洱茶学院云南普洱665000;2普洱茶研究院云南普洱665000)

普洱咖啡香气浓郁，口感醇厚，油脂丰富，有较愉悦的果酸味［1］。小粒咖啡产业是云南省发展高原特色农业和精准扶贫的重点内容，其中普洱市小粒咖啡适宜性最好［2-3］。鉴于咖啡在经济发展中的重要地位和种植过程中技术升级、创新的迫切要求，积极培育咖啡树新品种无疑会推动咖啡产业的快速发展［4］。茶属于杜鹃花目山茶科山茶属（Camellia sinensis）多年生木本植物，而咖啡属于龙胆目茜草科（Rubiaceae）一种多年生常绿灌木或小乔木［5］。远缘嫁接一般指种间、属间、科间等亲缘关系较远的植物之间的相互嫁接［6］，因此，茶与咖啡的嫁接属于跨目远缘嫁接。

据文献报道，嫁接可以提高植物株型、生产力和抗逆性等。云南省采用嫁接技术进行茶树选种、良种繁育、更新换种，嫁接后茶叶产量增加，而且嫁接可以降低育种的时间和费用［7］。董云萍等［8］采用大粒种（查理种）为砧木、中粒种‘热研3号’为接穗进行种间嫁接，发现嫁接后咖啡米的粒径增大，而化学组分含量和杯品品质无改变。杨维时［9］利用同属不同种不含咖啡碱的油茶为砧木嫁接茶树，选育低咖啡碱茶树品种。不同嫁接技术已被广泛运用于作物育种和品种改良。

利用嫁接技术对山茶科的优良茶树种和茜草科的优良咖啡树种进行融合，可为筛选和培育兼具茶树和咖啡树两种优良性状的“咖啡茶”树新品种奠定基础。此外，由于茶叶和咖啡中也含有一些对人体健康不利的物质，例如茶叶中含有一些导致肝毒性的物质；而咖啡豆中含有咖啡白醇和咖啡醇可以导致血清胆固醇升高，诱发心肌梗死。通过培育“咖啡茶”新品种，可望能够富集茶叶和咖啡中的健康元素，规避两者的有害物质。因此，该项目还将有利于云南茶和咖啡产品的优化和升级、更新换代。

试验地点和材料选取可直接影响嫁接的成活率。本次试验在云南省普洱市茶叶科学研究所（原茶树良种场）开展，场地中的空气相对湿度达75%。而普洱市属于高海拔地区，光照强度大，应选用可大幅度降低光照强度的遮阴网。砧木取自5年生茶树和5年生咖啡树，接穗均为当年生春梢［10］。

1 材料与方法

1.1 材料

茶氨酸（纯度99.7%，美国sigma公司）、咖啡碱标准品（国药集团化学试剂有限公司）；萘乙酸NAA（百奥莱博）、快活林伤口愈合剂（河南中威高科技化工有限公司），咖啡树砧木（Iron PickupCoffee）、茶接穗（C.sinensis var.assamica cv.Duanjiebaihao）。

1.2 方法

1.2.1 咖啡树砧木嫁接茶接穗［11-12］

1.2.1.1 咖啡树为砧木的劈接法（切接法）

2017年1月份，开展以咖啡树为砧木嫁接茶穗试验。选择5年左右咖啡树作为砧木，选择50穗生长健壮、无病虫害、半木质化当年生春梢茶树枝条为接穗。其中，30穗作为对传统嫁接法嫁接，标记为A-1；10穗采用100滋g/mL NAA浸泡1 h，标记为A-1a；10穗使用植物伤口愈合剂（植物伤口愈合剂［13］即医用胶水）涂抹，标记为A-1b，操作方法：在嫁接前，将其均匀涂抹在接穗及砧木楔面上。

2018年采用异穗并接法和组织黏胶粘合法试验，以茶树40穗枝条为接穗，其中，10穗采用异穗并接法嫁接，标记为B-1；10穗用组织黏胶异穗并接法，标记为B-1a；10穗使用单穗嫁接法，标记为B-2；10穗使用医用组织胶单穗嫁接法，标记为B-1c。

2019年汲取了上两年的经验并查阅大量文献资料后，采用传统法、同株不同穗套袋法和植物生长激素（NAA、IAA）处理法进行嫁接试验，以茶树180穗枝条为接穗。传统方法记为C-1，同株不同穗法标记为D-1，同株不同穗套袋法标记为t，用生长激素NAA处理记为a，用生长激素IAA处理记为b。咖啡砧木劈接法见图1。

图1咖啡砧木劈接法

1.2.1.2 咖啡树为砧木芽接法

2017年将传统芽接法标记为A-2；用100滋g/mL NAA浸泡1 h，标记为A-2a；10穗使用植物伤口愈合剂涂抹，标记为A-2b。2018年芽接法的处理：10穗采用异穗并接法嫁接，标记为B-2；10穗采用组织黏胶异穗并接法粘合法，标记为B-2a；10穗使用单穗嫁接法，标记为B-2b；10穗使用医用组织胶单穗嫁接法，标记为B-2c。2019年传统方法标记为C-2，同株不同穗法标记为D-2，同株不同穗套袋法标记为t，用生长激素NAA处理标记为a，用生长激素IAA处理标记为b。咖啡砧木芽接法见图2。

1.2.1.3 咖啡嫁接咖啡

2017年至2019年3年间都利用5年左右咖啡树为砧木，咖啡树枝芽为接穗，采用劈接法（切接法）标记为E-1，芽接法标记为E-2，各嫁接10穗，作为对照实验。

1.2.2 靠接［14］

1.2.2.1 咖啡与茶树靠接

图2咖啡砧木芽接

用5年以上根系发达、粗度基本一致的短节白毫和铁皮卡作为靠接材料，每处理各设置5株树（后5个处理均是靠接2株）。劈接法（切接法）标记为D-1，芽接法标记为D-2，各嫁接10穗，作为对照实验。靠接20 d后检查其成活率，如未成活及时补接。咖啡与茶树靠接见图3。

图3茶树与咖啡靠接

1.2.2.2 靠接茶树叶片和咖啡叶片茶多酚和咖啡碱含量的测定［15］

待靠接嫁接完全愈合后，再把砧木的上部和接穗的下部剪去，生长1年后，采摘6年生长叶龄的咖啡和茶的鲜叶，萎调24 h，微波杀青5 min，60℃烘干制成绿茶；制样，采用高效液相色谱法（HPLC）分别测定茶穗、咖啡穗、茶对照组和咖啡对照组中茶多酚和咖啡碱的含量。

2 结果与分析

2.1 劈接法对茶树（接穗）∕咖啡（砧木）嫁接组合成活率的影响

2017年选择50穗茶树枝条为接穗，试验结果见表1。以咖啡作为砧木、茶树枝条作为接穗，用传统劈接法进行嫁接时，最长存活时间仅为72 d，此时存活率为3%。使用植物生长激素（NAA）浸泡的接穗最长仅存活37 d，此时存活率为20%。而使用伤口愈合剂的穗条存活时间较短，22 d时均死亡。

表1 2017年茶树（接穗）/咖啡（砧木）嫁接组合劈接法成活率

2018年茶树（接穗）与咖啡（砧木）嫁接组合劈接法成活率见表2。以咖啡作为砧木、茶树枝条为接穗，采用异穗并接法进行嫁接，有3穗存活82 d；单穗嫁接法嫁接的10穗中，存活94 d的有2穗；使用医用组织胶单穗嫁接法的10穗存活率最低，存活时间最短，异穗并接法（组织黏胶）次之。

表2 2018年茶树（接穗）/咖啡（砧木）嫁接组合劈接法成活率

2019年茶树（接穗）/咖啡（砧木）嫁接组合劈接法成活率见表3。传统方法＋同株不同穗套袋法嫁接中有1穗存活至214 d，存活时间最长；其次是传统方法＋同株不同穗法套袋法＋NAA嫁接、传统方法＋同株不同穗套袋法＋IAA，均有1穗存活至163 d；再次是传统方法＋NAA、传统方法＋IAA，均有1穗存活至101 d；嫁接效果最差是传统嫁接法，仅有2穗存活至81 d。

表3 2019年茶树（接穗）/咖啡（砧木）嫁接组合劈接法成活率

2.2 芽接法对茶树（接穗）∕咖啡（砧木）嫁接组合成活率的影响

2017年芽接法与穗接法处理相同，试验结果见表4。以咖啡作为砧木、茶树枝条作为接穗进行芽接法时，传统芽接法的存活时间最长，5穗存活至171 d，此时存活率为50%；其次是植物生长激素浸泡（NAA，100滋g/mL，1 h）的芽接法，有1穗存活至141 d，此时存活率为10%；嫁接效果最差的是植物伤口愈合剂涂抹法，嫁接50 d时即全部死亡。

表4 2017年茶咖互嫁试验咖啡砧木芽接法成活率

2018年茶咖嫁接咖啡砧木芽接法成活率见表5。以咖啡作为砧木、茶树枝条作为接穗进行芽接法时，使用单穗嫁接法的存活时间最长，有2穗存活至130 d，此时存活率为20%；其次是异穗并接法，第100天时存活率为20%，此时组织黏胶异穗并接法粘合法和医用组织胶单穗嫁接法的存活率均为10%。

表5 2018年茶咖互嫁试验咖啡砧木芽接法成活率

2.3 咖啡嫁接咖啡对成活率的影响

咖啡互嫁劈接法和芽接法成活率见表6。咖啡互嫁中，芽接法也仅存活了2个月，劈接法目前有3穗已经存活至7个月，且已经长出新枝。由此可见，芽接法在咖啡互相嫁接中不易存活，应适当改进嫁接方法。

表6咖啡互嫁劈接法和芽接法成活率

2.4 靠接法对茶咖互嫁成活率的影响

靠接法，即接穗并不从母体上剪截下来，而是将用作接穗的植株种在砧木的近旁，把茎干互相靠拢起来进行嫁接，待接穗和砧木完全愈合后再把砧木的上部和接穗的下部剪去。试验采用二年生茶树和二年生咖啡幼苗三七对间植（图3），在同等位置分别切出伤口，然后将茶树和咖啡互相绑结在一起，由于接穗在嫁接时都未脱离母体，目前茶树和咖啡都是存活状态，但未见伤口愈合。

2.5 茶树与咖啡靠接对茶多酚与咖啡碱的影响

茶多酚在茶树无嫁接（即茶CK）和咖啡无嫁接（咖啡CK）中的含量相近，分别是18和17.8 mg/g；而在咖啡为砧木嫁接茶穗（即茶穗）中的含量为10.8 mg/g（图4），比在咖啡为砧木嫁接咖啡穗（即咖啡穗）中的含量（15 mg/g）低。茶CK咖啡碱含量为3 mg/g，高于咖啡CK的含量（1.3 mg/g）；茶穗咖啡碱含量为1.6 mg/g，与咖啡穗（1.2 mg/g）相差不多。茶穗嫁接法见图5。

图4茶树与咖啡靠接对茶多酚与咖啡碱的影响

图5茶树、咖啡树嫁接图

2.6 靠接后茶树与咖啡细胞形态差别

2.6.1 嫁接显微结构

参考陈军亮等［16-17］的方法，将茶树、咖啡树木质化茎做成石蜡切片（图6），对与嫁接有关的结构进行了比较，结果表明两者的形成层在形态学上差异较大。将茶树与咖啡的嫩茎制成石蜡切片（图7～8），结果表明两者在分生组织处的结构差异较大。远缘嫁接的新生嫩茎比原生嫩茎的细胞强度差，细胞腔间隙大；嫁接点部位的薄壁细胞分裂形成大量愈伤组织，通过愈伤组织的形成，使砧木与接穗在接口处愈合；接入砧木内的接穗部分，外围的薄壁组织恢复分裂，形成大量的增生组织。

图6茶树、咖啡树木质化茎做成石蜡切片

茶树的分生组织出现在单侧，而咖啡的分生组织是对称生长（图9～10）。茶树嫩茎的形成层变化过程是由圆形变成葫芦型，然后长成椭圆形；咖啡形成层变化过程是由纺锤形过度成椭圆形，再形成哑铃型。这是由于茶树叶片或花芽是互生生长，咖啡叶片或花芽是对生生长，这就造成两者形成分生组织方式有所差异。

图7咖啡嫩叶石蜡切片100X

图8咖啡嫩茎石蜡切片100X

2.6.2 靠接后茶树和咖啡嫩茎的亚显微结构

图9靠接茎冷冻切片（左为咖啡茎，右为茶树茎）

图10靠接茎愈合点冷冻切片（左为茶树，右为咖啡树）

电子显微镜下观察发现，咖啡嫩茎（图11）表面有少量类似腊质物质覆盖，而茶树嫩茎则无；但茶树嫩茎表面（图12）有大量长度大约100～200滋m的茸毛细胞，咖啡嫩茎表面光滑。亚显微结构显示，茶与咖啡的形成层厚度有较大差异，观察2种植物的导管（图13～14）发现，茶树与咖啡树的导管组织在亚显微结构中都呈螺纹状。

图11咖啡嫩茎表皮冷冻电镜

图12茶嫩茎表皮冷冻电镜

图13靠接后咖啡茎电镜切片

图14靠接后茶茎电镜切片

3 讨论

2017～2019年，共开展3轮次的茶树、咖啡远缘嫁接试验，咖啡树作为砧木、茶树为接穗的劈接法，一共有10穗枝条相继发芽，到目前为止，仅有一株保持生物活性超过10个月（2020年2月），多数都不超过6个月。芽接法均没有出现发芽植株。咖啡嫁接咖啡试验中，2017年存活率较低，2018年无存活植株，2019年存活率都在70%以上。试验结果表明，嫁接常与季节有关，2018年嫁接较晚，成活率低；芽接法常不如穗接法存活率高；套袋可有效提高嫁接的成活率；生长激素对嫁接的成活率有一定的影响，但在本试验中表现不明显；植物伤口愈合剂和医用组织黏胶（胶水）对植物嫁接无影响。

植物显微结构也表明，茶树与咖啡树在形态结构上有差异。本研究也对靠接试验植株进行分离处理，结果表明，2株植物接触面仍容易完整分离，两者并没有粘合，都已木质化并各自长出愈伤组织，仅是通过外界物理作用力勉强结合在一起，两者结合部位已出现畸形生长。对靠接植株叶片茶多酚进行检测分析发现，茶多酚在茶CK和咖啡CK中含量相近，而在咖啡为砧木嫁接茶穗（即茶穗）中含量比咖啡为砧木嫁接咖啡穗（即咖啡穗）中的含量低。咖啡碱在茶CK中含量高于咖啡CK，在茶穗和咖啡穗中含量相差不多。

嫁接是一项劳动技能，嫁接成功与否常与劳动者的操作熟练程度有很大关系。2017年嫁接存活率低可能与嫁接工人操作水平有一定相关性。2018年聘请了熟练工人嫁接，采用老枝封蜡，由于嫁接季节较晚，导致成活率也较低［18］。2019年总结了2次经验，当年正常嫁接的成活率约90%，远缘嫁接新发芽植株也较多；多数新发芽植株长至二叶期时，就出现萎蔫现象，随后枝条又重新长出枝条，仅有一两株能长出枝条，但不能木质化；新长出枝条明显出现干瘪，与正常枝条明显不同。

组织黏胶不仅能够在组织液阴离子的作用下能快速聚合固化成膜，并与楔面镶嵌紧密，牢固地保持伤口的对合状，促进愈合，还能够将组织和细菌隔离，具有抗感染和保护创面的作用，同时还具有组织液中阴离子的作用。

综合3个试验研究发现，茶树与咖啡树分属于不同的科、目，且植物的形态结构、生理生化特点相差甚大，属于远缘嫁接的植物育种，其变异率比近缘嫁接高［19］，而成活率一般比较低［20］，所以，本研究到目前为止，一直未能嫁接成活，试验具有极大的挑战性。砧木和接穗不亲和，不能生长愈伤组织，导致输导组织不能联通，生长物质引起导管或筛管阻塞，不能进行营养交换。根据茶氨酸和咖啡碱的含量可以判断茶叶的品质［21］，从靠接后茶多酚和咖啡碱含量来看，靠接后茶多酚和咖啡碱含量均有所降低，这与靠接后植物间发生了物质交换有关。

下一步研究应结合先进的生态学理论和技术实现茶与咖啡远缘嫁接技术的突破，并对嫁接过程中出现的嫁接不亲和情况进行分析，从分子水平上探索远缘嫁接亲和与不亲和的机理，可为利用茶树、咖啡相互嫁接选育新品种提供科学依据和技术基础。