不同浓度胰岛素对原代大鼠脂肪细胞增殖分化的研究

雷世成，卢建雄

（1.兰州职业技术学院,甘肃 兰州 730070；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

胰岛素(insulin)是由生物体胰脏内的胰岛细胞所分泌的一种对脂肪细胞具有调节作用的蛋白激素，同时能够对蛋白、糖原、脂肪等生物大分子的合成具有促进作用。外源性胰岛素主要在临床上用于治疗糖尿病。低浓度的胰岛素它能促进脂类合成并且也有支持其他药物的脂肪积聚作用[1]。胰岛素是调节机体内环境的重要激素之一，在机体代谢中起重要作用。胰岛素能调节能量平衡，调控脂肪细胞内基因转录、蛋白质合成和脂质代谢等，从而影响脂肪细胞的生长[1，2]。在一定浓度范围内胰岛素敏感性增加能够正向加速脂肪细胞的分化过程[3，4]。根据 Flores 等[5]的定义，细胞分化（differentiation）是指同一来源的细胞逐渐产生形态结构、功能上有差异的细胞群体。脂肪细胞分化由脂肪母细胞、前体脂肪细胞、不成熟脂肪细胞到成熟脂肪细胞的过程[6]。但是目前在生物医学研究领域对干细胞向脂肪细胞分化的机理还不太清楚，而对前体脂肪细胞向脂肪细胞分化机理的研究的比较深入。在体内脂肪细胞是在相关转录因子的调控作用下激活调控脂肪细胞的因子，经过一系列复杂的增殖分化机制转化为成熟脂肪细胞[7]。

1 材料和方法

1.1 试验动物

健康的3周龄SD雄性大鼠9只（健康，100 g左右，购自兰大动物医学中心）。该大鼠的采食量一般5 g（100 g体重24 h），温度在18～26℃，相对湿度40%～70%，通风换气6次/h。

1.2 试验方法

断颈处死SD大鼠并用75%的酒精消毒处理，在无菌状态下取出附睾和肾脏周围的脂肪组织，除掉毛细血管和其他结缔组织，用含有双抗的PBS冲洗2遍并剪碎。剪碎的脂肪组织块中加入胰蛋白酶进行消化，消化50 min (每隔10 min振荡1次），然后用孔径为600目的不锈钢过筛，1 000 r/min（半径8 cm）离心10 min，弃上清液，然后用无血清培养液洗2遍，加入含有10%血清的DMEM/F12培养基吹打均匀，即可获得脂肪细胞悬液，然后转入到细胞培养瓶，放进CO2培养箱进行培养。

1.2.1 胰岛素对大鼠脂肪细胞增殖活性检测（MTT法） 培养的大鼠脂肪细胞密度为5×104/cm2时接种于96孔培养板当中，预设胰岛素浓度分别为0 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、300 nmol/L、400 nmol/L、500 nmol/L，以0 nmol/L为对照组（不添加任何胰岛素），每孔总容积为220μl。分别处理2 d、4 d、6 d和8 d进行MTT比色测定，记录光吸收值（A）。

1.2.2 胰岛素对油红O染色提取检测大鼠脂肪细胞分化程度 培养的大鼠脂肪细胞按5×104/cm2的密度接种于24孔培养板，按预设浓度加入胰岛素稀释液，每个浓度需设3个重复增加数据的准确率，每孔容积为4μl，每2 d换1次培养液，在第6 d将培养板从CO2培养箱中取出，倒掉其培养基，PBS冲洗2次，用10%的甲醛溶液固定1 h，PBS溶液冲洗3次，油红O染液染色60 min，移除油红O染液，再用PBS冲洗3次，100%异丙醇萃取油红O染液，用酶联检测仪分析，记录光吸收值（A）。

1.2.3 试验设计与数据统计分析方法 试验数据以平均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS21统计软件进行单因素方差分析与显著性检验。实验数据以平均值±SD表示。

2 结果与分析

2.1 胰岛素对大鼠脂肪细胞生长活性的影响

在倒置显微镜下观察培养3 d的脂肪细胞形状和变化，正常培养的脂肪细胞第3 d呈梭形或不规则三角形(如图1)，添加低浓度胰岛素培养3 d脂肪细胞已出现脂滴（如图2），此时脂滴数量多而体积小，随着时间的延长，以后脂滴会慢慢开始融合、分化的细胞也增多，细胞形态逐渐趋向于圆形或类圆形，从而获得成熟脂肪细胞的形态特征。

图1 培养3 d的脂肪细胞生长形态(200×)

图2 添加低浓度胰岛素培养3 d脂肪细胞生长形态（200×）

2.2 胰岛素对大鼠脂肪细胞增殖的影响（MTT法）

检测培养的大鼠脂肪细胞密度为5×104/cm2时接种于96孔培养板当中，按预设添加不同浓度胰岛素，每个浓度需设3个重复增加数据的准确率，以0 nmol/L为对照组（不添加任何胰岛素），每孔总容积为220μl。分别处理2 d、4 d、6 d和8 d进行MTT比色测定，记录光吸收值（A），结果如表1所示。

结果表明与对照组相比，胰岛素浓度在100～400 nmol/L范围时，胰岛素促进大鼠脂肪细胞增殖差异显著，胰岛素浓度在300 mmol/L时大鼠脂肪细胞增殖能力最强。随着胰岛素浓度升高到500 nmol/L时，对脂肪细胞的增殖作用减弱，并且只在第4～6 d差异显著，以后差异不显著，这就验证了中低浓度的胰岛素能够促进大鼠脂肪细胞的增殖。

表1 MTT检测结果

2.3 胰岛素对大鼠脂肪细胞分化的影响（油红O染色）

在倒置显微镜下观察培养5 d的脂肪细胞形状和变化，正常培养的脂肪细胞第5 d呈梭形或不规则三角形慢慢地分化为少量的脂滴(如图3)，添加低浓度胰岛素培养5 d脂肪细胞已出现大量的脂滴（如图4），随着时间的延长，以后脂滴会慢慢开始融合，细胞形态逐渐趋向于圆形或类圆形的大脂滴，从而获得成熟脂肪细胞的形态和特征。

图3 培养5 d的脂肪细胞油红染色（200×）

图4 添加低浓度胰岛素培养5 d的脂肪细胞油红染色（200×）

2.4 胰岛素对油红O染色提取检测大鼠脂肪细胞的分化程度

检测培养的大鼠脂肪细胞按5×104/cm2的密度接种于24孔培养板，按预设浓度加入胰岛素稀释液，以0 nmol/L为对照组（不添加任何胰岛素），每个浓度需设3个重复增加数据的准确率，油红O染液染色60 min，移除油红O染液，再用PBS冲洗，然后用100%异丙醇萃取油红O染液，用酶联检测仪分析，记录光吸收值（A），结果如表2所示。

表2 油红O染色检测分化程度

试验分析表明，与对照组相比，胰岛素浓度在200～400 nmol/L时，大鼠脂肪细胞分化有显著的促进作用；当胰岛素浓度在500 nmol/L时脂肪细胞分化能力最强，这就说明高浓度的胰岛素能促进大鼠脂肪细胞的分化。

3 结论

在脂肪细胞形成过程中，当胰岛素的浓度在300～400 nmol/L脂肪细胞的增殖能力较强，500 nmol/L脂肪细胞的分化作用最强，这是因为胰岛素通过与受体结合调节细胞内脂质生成与降解的酶有关。通过试验分析说明中低浓度的胰岛素可促进脂肪组织的合成，高浓度可诱发脂肪组织的分解。从而也证实了胰岛素是重要的大鼠脂肪细胞增殖分化的蛋白激素。为进一步研究脂肪细胞增殖分化的相关转录因子碳水化合物反应元件结合蛋白（ChREBP）、固醇调节元件结合蛋白（SREBP-1c）和乙酰辅酶A脱羧酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)调控关系奠定基础，为临床上肥胖病和糖尿病发病机制的进一步研究和治疗效果提供保障。