骨质疏松易感SNP rs4325274通过增强子远程调控SOX6基因的功能机制研究

妥晓梅，朱东丽,2，陈晓峰，荣誉，郭燕，杨铁林,2

研究报告

骨质疏松易感SNP rs4325274通过增强子远程调控基因的功能机制研究

妥晓梅1，朱东丽1,2，陈晓峰1，荣誉1，郭燕1，杨铁林1,2

1. 西安交通大学生命科学与技术学院，生物医学信息工程教育部重点实验室，生物医学信息与基因组学中心，西安 710049 2. 浙江西安交通大学研究院，杭州 311215

骨质疏松症是一种典型的多基因复杂疾病，遗传力高达85%，其发病率已跃居常见疾病的第5位。尽管已经鉴定出大量骨质疏松易感SNP，但大多数SNP位点位于基因组非编码区，且功能机制未知。本研究旨在通过生物信息学分析和功能实验探究骨质疏松非编码功能性易感SNP rs4325274的分子调控机制。首先，通过表观注释发现该SNP所在区域处在增强子上，eQTL和Hi-C分析结果发现SNP调控的潜在靶基因是；然后，利用多种数据库进行Motif预测，并结合GEO数据库中的ChIP-seq数据分析进行了验证，结果发现转录因子更倾向于结合SNP rs4325274-G碱基；进一步通过双荧光素酶报告基因实验验证了该SNP对基因表达的增强作用；最后，利用shRNA敲低转录因子实验，检测靶基因的表达变化。以上研究结果初步解析了非编码区功能性SNPrs4325274作为增强子远程调控基因表达的分子机制，为复杂疾病非编码易感SNP的遗传调控研究提供新思路。

SNP rs4325274；基因；转录因子；骨质疏松症发生机制

骨质疏松症是一种世界范围内流行的全身性骨代谢性疾病，以骨量减少和骨组织微结构损坏为特征[1]。由于其高发病率、高死亡率以及高医疗花费[2~4]，骨质疏松症已成为当前亟需解决的公共健康问题之一。但至今骨质疏松症的遗传发病机制仍不清楚。因此，开展骨质疏松症的基础研究，深入探索其分子致病机制，对骨质疏松症的预防和临床治疗有着重要意义。

(SRY-box transcription factor 6)基因是SRY相关转录因子D亚家族的成员，在软骨细胞分化、软骨形成和软骨内骨形成中起着非常重要的调控作用[5,6]。当和基因同时缺失时，小鼠胚胎会发展成严重的泛发性软骨发育不良，在胚胎发育16.5天左右死亡[5]。另外，和协同基因调节软骨中II 型胶原()的表达来控制软骨的重塑，在治疗骨关节炎中软骨退变和软骨损伤修复中具有重要的临床应用价值[7,8]。本课题组前期研究发现基因参与了软骨形成和成骨的耦合调控作用[9]，这提示基因可能在骨质疏松发生过程起着非常重要的作用。

骨质疏松症的临床诊断和评估主要以骨密度(bone mineral density, BMD)为依据[10]，其遗传力高达0.6~0.8[11]。目前，国际上已有多项全基因组关联研究(genome-wide association study, GWAS)发现位于染色体11p15区的基因内部及上下游区的多个SNPs位点与股骨颈、腰椎和手腕骨密度等骨质疏松症表型显著关联[12~15]。但对于这些风险SNPs在骨质疏松症发生过程中的功能及作用机制至今尚不清楚。本课题组前期从骨质疏松症遗传因素联合会(genetic factors for osteoporosis consortium, GEFOS)下载和整理了所有与骨质疏松症相关表型的所有GWAS 数据，通过精细定位分析，筛选到基因上游区域中一个潜在的骨质疏松症易感causal SNP rs4325274位点，已有研究报道了该SNP位点与足跟部骨密度[16]和全身骨密度[17]表现出显著的关联性，值分别为1.60×10–42和1.73×10–13，但该SNP潜在的功能机制有待进一步研究。本研究将结合生物信息学分析以及功能实验，探究骨质疏松症易感SNP rs4325274调控基因表达的分子机制，以期为进一步解析骨质疏松症的发生机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

成骨细胞来源的U2OS细胞，用含有10%胎牛血清，100 U/mL的青霉素和100 µg/mL的链霉素的RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

1.2 主要试剂

菌株感受态细胞DH5a购自北京天根生化技术有限公司；双荧光素酶报告基因载体PGL-3 Basic、内参海肾载体phRL和ViaFect转染试剂均购自美国Promega公司；定点突变试剂盒购自北京天恩泽技术有限公司；限制性内切酶，DNA ligation Mix，ExDNA 聚合酶均购自日本TaKaRa公司；胶纯化回收试剂盒购自上海GENEray公司；血液/组织/细胞基因组DNA提取试剂盒，无内毒素质粒小量中提提取试剂盒均购自北京天根生化技术有限公司。

1.3 表观功能注释

利用ANNOVAR软件注释causal SNP rs4325274的基因组位置，利用WashU Epigenome Brower (http://epigenomegateway.wustl.edu/)在线网站，选取成骨细胞及GM12878的表观调控数据，包括各类激活型组蛋白修饰如H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac、P300以及DNase I 超敏感位点等，对SNP rs4325274所在区域进行功能注释。

1.4 顺式表达数量性状(expression quantitative trait locus, eQTL)分析

利用福明翰心脏研究(Framingham Heart Study, FHS)中的全血eQTL数据(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/ eqtl/original_submissions/FHS_eQTL/)进行eQTL分析。

1.5 高通量染色质互作(high-throughput chro­matin interaction analysis, Hi-C)分析

结合本实验室测得成骨细胞的Hi-C 数据、ChIP-seq 测序数据(doi: https://doi.org/10.1101/2020.05.25.114272)，利用实验室搭建的分析平台进行了Hi-C 分析，以期得到与SNP rs4325274 所在区域显著互作的成环片段。

1.6 双荧光素酶报告基因实验

1.6.1 野生型和突变型两种荧光素酶重组载体构建

构建含启动子片段的PGL3荧光素酶报告载体，正确载体命名为promoter-Luc+。然后，构建含SNP rs4325274片段的promoter-Luc+重组载体。NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对结果显示SNP位点为C碱基，故将构建好的重组载体命名为rs4325274-C-promoter-Luc+，在此基础上利用定点突变试剂盒进行C→G定点突变。首先，在CE Design V1.03网站上设计SNP rs4325274定点突变引物，然后根据基因定点突变试剂盒(D0206)操作说明书进行定点突变反应，正确载体命名为rs4325274-G-promoter-Luc+。相关引物序列见表1。

1.6.2 报告基因载体的转染及荧光素酶活性检测

分别将构建好的promoter-Luc+、rs4325274- C-promoter-Luc+和rs4325274-G-promoter- Luc+荧光素酶报告基因载体与内参海肾质粒(phRL) 共转染至成骨系细胞U2OS中，根据Dual Luciferase Reporter Assay System操作说明书，利用化学发光仪检测rs4325274两种碱基型增强子对基因启动子的调控活性，以确定其是否对基因有增强子作用。

表1 实验所用引物序列

、和下划线分别表示d III、I和I酶切位点。

1.7 Motif预测分析

从meme suite网站(http://meme-suite.org/doc/ meme.html?man_type=web)下载整理最新的人类转录因子Motif 数据库，包括JASPAR 2018、HO­COMOCOv11、SwissRegulon和TRANSFAC四个权威数据库的数据进行Motif 预测，分析能够与增强子上目标SNP rs4325274结合的转录因子，以及SNP rs4325274不同碱基型的改变是否会影响转录因子的结合情况。利用GEO数据库里的ChIP-seq数据集分析在SNP rs4325274位点处是否有转录因子的结合信号。

1.8 转录因子shRNA敲低实验

首先在U2OS细胞中，对SNP rs4325274进行了分型，利用血液/组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取U2OS细胞的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，将得到的PCR产物送北京擎科生物科技有限公司进行测序检测SNP基因型。

本研究选取文献[19]已报道的-shRNA寡核苷酸序列为shRNA序列：-shRNA1：5ʹ-GGCAGAAGAACCCTAGCAA-3ʹ，-shRNA2：5ʹ-GGTCTTCACCTCAGACACT-3ʹ，sh-NC：5ʹ-GTT­CTCCGAACGTGTCACGT-3ʹ，构建到miR-30骨架上，经I和R I双酶切克隆到pcDNA3.1表达载体上，酶切及测序鉴定验证，即构建好sh--1，sh--2和sh-NC (空白对照)表达质粒。然后用ViaFect转染试剂分别转染U2OS细胞。转染48h后，提取细胞总RNA，反转录，用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测的敲低情况及基因mRNA水平的表达情况。qRT-PCR检测引物序列见表1。

2 结果与分析

2.1 表观注释提示SNP rs4325274处于成骨细胞相关增强子上

利用ENCODE数据库里的成骨细胞及GM12878的ChIP-seq数据对筛选出的SNP rs4325274所在区域进行表观注释，利用WashU可视化工具作图，发现SNP rs4325274周围富集了多个具有较强的激活型组蛋白标记，如H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac，以及转录激活因子P300和DNase I 超敏感位点(DHS) (图1)，提示SNP rs4325274处于增强子元件内，初步推断该SNP所在区域可能是一个增强子。

2.2 eQTL和Hi-C分析发现易感SNP rs4325274作用的靶基因可能是SOX6基因

研究发现，基因组可折叠成环使得直线物理位置较远的增强子和靶基因的启动子在三维结构上接近，进而发挥调控作用[20,21]。为了证明易感SNP rs4325274与靶基因之间的关系，利用FHS中5257个人的全血eQTL数据进行了eQTL分析，结果发现SNP rs4325274 (= 2.06×10–12)与基因之间的关系较显著。利用本课题组前期对成骨细胞高分辨率的Hi-C测序数据及搭建好的Hi-C分析流程，数据分辨率为2 kb，发现非编码区SNP rs4325274与基因存在远程互作(图2)。

图1 SNP rs4325274组蛋白注释结果(采用Wash U基因组浏览器可视化)

eQTL分析和Hi-C分析结果表明，易感SNP rs4325274所调控的靶基因可能是基因。

2.3 rs4325274对SOX6基因表达具有增强子调控活性

分别将包含rs4325274(C/G)不同等位基因的片段(约0.8 kb)及基因启动子区片段(约1.2 kb)克隆到荧光素酶报告基因载体(PGL3-Basic)上，与内参海肾质粒(phRL)共转染至U2OS细胞中，检测其荧光素酶活性。结果发现，相比只含基因启动子的载体，含SNP不同等位基因的重组载体表达活性显著增强，且含有G碱基的载体表达活性相比C碱基的载体表达活性显著增强(图3)，这进一步证实了SNP rs4325274所在的片段是作为一个增强子来调控基因表达，而且不同等位基因调控活性有差异，其中G等位基因的调控活性更高。

图2 Hi-C数据分析结果示意图

2.4 Motif预测发现rs4325274结合转录因子HNF1A

根据JASPAR 2018、HOCOMOCOv11、Swiss­Regulon和TRANSFAC四个权威数据库对SNP rs4325274 (G/C)序列进行转录因子预测，结果同时在SwissRegulon和TRANSFAC数据库中发现SNP rs4325274都结合转录因子，而且转录因子更倾向于结合rs4325274-G等位基因(图4)。因此，推测SNP rs4325274通过不同基因型结合转录因子的活性对增强子具有潜在的激活作用。

图4 转录因子HNF1A结合DNA序列和SNP位置

*：SNP rs4325274位点。

图3 双荧光素酶报告基因活性检测rs4325274的增强子活性结果

数据为均值 ± 标准差；*：<0.05；**：< 0.01。

图5 ChIP-seq数据分析结果(采用IGV工具可视化)

为了验证rs4325274可能与转录因子结合，从GEO数据库中获得转录因子的ChIP-seq数据(NO：GSM2534454)，利用IGV (Inte­grative Genomics Viewer)工具可视化作图，发现rs4325274位于ChIP信号富集区(图5)，这一结果进一步说明了rs4325274可能会结合转录因子。

2.5 HNFIA敲低后SOX6表达降低

对SNP rs4325274在U2OS细胞中进行了分型，分型结果显示rs4325274在U2OS细胞中是杂合型(G/C)(图6)，确保了后续敲低实验的进行。

为进一步探究SNPrs4325274是否通过影响转录因子结合机制调控靶基因的表达，本研究构建了-shRNA敲低载体，转染至U2OS细胞，利用qRT-PCR检测基因的表达情况。结果表明，与阴性对照shRNA转染细胞相比，在转录因子敲低的U2OS细胞中，基因的表达显著降低(图7)。这一结果提示可能是SNP rs4325274调控机制中的潜在调节因子，通过目标SNP-转录因子–靶基因的调控机制，进而导致疾病的发生。转录因子与SNP rs4325274等位基因的特异性结合需进一步实验去验证。

图6 rs4325274在U2OS细胞中的分型结果

图7 在U2OS细胞中敲低HNFIA对SOX6表达的影响

数据为均值 ± 标准差；***：<0.001；**：<0.01。

3 讨论

骨质疏松症是一种受多基因调控的复杂疾病[11]，其遗传力高达85%[22]。随着基因组技术的发展，大规模GWAS的开展，已经成功鉴定了大量与骨质疏松症骨密度相关联的易感变异位点。目前，破译这些易感位点影响疾病发生的功能机制，进而为临床转化提供潜在治疗靶点，是后GWAS时代的研究热点和难点[23]。

近年来，随着ENCODE[24,25]和Roadmap[26]计划结果的陆续公布，提供了大量人类基因组上的各种表观调控信息，这为解析非编码区疾病位点的功能提供了新的契机。本研究利用ENCODE数据对骨质疏松易感SNP rs4325274进行表观注释，发现SNP rs4325274位于增强子区域。为进一步证明易感SNP rs4325274与靶基因之间的关系，利用eQTL分析和Hi-C分析发现易感SNP rs4325274所调控的靶基因可能是基因。在此基础上通过功能实验证实该SNP确实对基因表达有增强子调控活性，并发现rs4325274-G等位基因表达活性比rs4325274-C等位基因显著增强。

研究表明，SNP影响疾病易感性的机制之一就是通过影响转录因子与DNA的结合调控基因表达[27]，在骨质疏松症发生机制中已有相关研究报道。Xiao等[28]研究证明转录因子特异性结合rs9547970的主等位基因A而非等位基因G，通过该机制调控基因的转录活性，从而影响骨形成。基因上的rs4317882与骨密度关联，该研究者[29]同时又证实了转录因子可特异性结合rs4317882的风险等位基因A而非等位基因G。本课题组前期在解析骨质疏松症热点区域13q14.11中易感SNP位点的机制时，证明rs9533090-C等位基因可以大量招募激活型转录因子，提高其增强子活性，从而增强骨质疏松明星基因表达的机制[30]。

为进一步探究易感SNP rs4325274位点调控基因表达的机制，本研究利用多种数据库进行了Motif预测，发现SNP rs4325274结合的转录因子，并结合ChIP-seq数据分析进行验证，发现rs4325274位于转录因子ChIP信号富集区，进一步利用shRNA干扰转录因子，发现在基因敲低的细胞中，基因的表达显著降低。由此推测骨质疏松易感SNP rs4325274可能通过影响与转录因子的特异性结合来调节基因表达。后续本课题组会进一步通过染色质互作(chromosome conformation capture, 3C)实验和染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)等实验来深入探究该SNP位点与转录因子及靶基因基因之间的作用机制，并在细胞水平和动物模型深入探究基因在骨质疏松症发病中的真正作用机制。

综上所述，本研究初步解析了非编码区功能性SNPrs4325274作为增强子远程调控基因表达的分子机制。研究结果将有助于为复杂疾病非编码易感SNP的遗传调控研究提供新思路，并为骨质疏松症的药物开发和治疗提供潜在的药物靶点。

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The osteoporosis susceptible SNP rs4325274 remotely regulates thegene through enhancers

Xiaomei Tuo1, Dongli Zhu1,2, Xiaofeng Chen1, Yu Rong1, Yan Guo1, Tielin Yang1,2

Osteoporosis is a typical polygenic disease, and its heritability is as high as 85%. The incidence of osteoporosis has jumped to the fifth among the common diseases. Although a large number of osteoporosis-susceptible SNPs have been identified, most of them are in the non-coding regions of the genome and the functional mechanisms are unknown. The purpose of this study was to explore the function of non-coding osteoporosis-susceptible SNP rs4325274 and dissect the molecular regulatory mechanisms through integrating bioinformatics analysis and functional experiments. Firstly, we found the SNP rs4325274 resided in a putative enhancer element through functional annotation. eQTL and Hi-C analysis found that thegene might be a potential distal target of rs4325274. We conducted the motif prediction using multiple databases and verified the result using ChIP-seq data from GEO database. The result showed that the transcription factorcould preferentially bind to SNP rs4325274-G allele. We further demonstrated that SNP rs4325274 acted as an enhancer regulatinggene expression by using dual-luciferase reporter assays. Knockdown ofdecreased thegene expression. Taken together, our results uncovered a new mechanism of a non-coding functional SNP rs4325274 as a distal enhancer to modulateexpression, which provides new insights into deciphering molecular regulatory mechanisms underlying non-coding susceptibility SNPs on complex diseases.

SNP rs4325274;gene; transcription factor; mechanism of osteoporosis

2020-05-26;

2020-09-04

国家自然科学基金面上项目(编号：31771399，31970569)，中国博士后基金项目(编号：2019M650261)，陕西省自然科学基础研究计划项目(编号：2020JQ-026)和浙江省自然科学基金(编号：GF18C060003)资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31771399, 31970569), China PostdoctoralScience Foundation (No. 2019M650261), Natural Science Basic Research Plan in Shaanxi Province of China (No. 2020JQ-026), and the Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (No. GF18C060003)]

妥晓梅，在读硕士研究生，专业方向：疾病分子遗传机制的基础研究。E-mail: xmt18392079044@stu.xjtu.edu.cn

杨铁林，博士，教授，研究方向：生物信息分析及复杂疾病遗传致病机制研究。E-mail: yangtielin@xjtu.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-098

2020/9/10 7:21:15

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20200908.1130.004.html

(责任编委: 周钢桥)