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用于临床新型冠状病毒核酸检测的分子诊断新技术

2020-09-24谢春梅武海萍马雪萍周国华

遗传 2020年9期
关键词:恒温靶标核酸

谢春梅,武海萍,马雪萍,周国华,2

综 述

用于临床新型冠状病毒核酸检测的分子诊断新技术

谢春梅1,武海萍1,马雪萍1,周国华1,2

1. 南京大学医学院附属金陵医院(东部战区总医院)临床药学科,南京 210002 2. 南方医科大学药学院,广州 510515

目前新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019, COVID-19)在全球仍呈现大流行趋势,该病潜伏期长、传染性强,给全世界人民的健康安全带来严重威胁。新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)核酸检测作为COVID-19确诊的重要依据之一,在疫情防控工作中发挥了巨大的作用。截至2020年8月17日,国家药品监督管理局已应急批准15个新型冠状病毒核酸检测试剂盒,其中10个试剂盒是以逆转录-实时荧光定量PCR (RT-qPCR)为主要技术原理,其余试剂盒分别采用了不同于RT-qPCR的5种分子诊断技术。本文对上述检测试剂盒所使用的技术原理、反应时间、优缺点等方面进行了介绍,以期为COVID-19及类似传染病的快速筛查、确诊、防控提供更多的方案思路。

新型冠状病毒;核酸检测;分子诊断

2019年12月,湖北省武汉市报道了数例以咳嗽、发烧、肺部感染为主要症状的不明原因肺炎,且存在明显的人传人现象。2020年1月经分离鉴定,确认导致该病的病原体为新型冠状病毒[1]。2月11日,国际病毒分类学委员会将该病毒正式命名为SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome co­ronavirus 2),同日,世界卫生组织将其引发的新型冠状病毒病命名为COVID-19 (corona virus disease 2019)。截至2020年8月17日,中国累计确诊病例9万例,现存确诊614例,现存无症状感染者356例。虽然疫情在国内得到了有效控制,但近日美国、巴西等国家的感染人数暴增,全球累计确诊病例已超过2500万例,死亡人数接近85万人。COVID-19已具有全球大流行趋势[2],疫情的爆发使全世界人民的健康安全及公共卫生财产面临巨大挑战。

研究报道,SARS-CoV-2是含有包膜的正义单链RNA病毒,此前在人体中从未被发现,是一种全新的β属冠状病毒。SARS-CoV-2基因组约由3万个核苷酸组成,与人类SARS-CoV的核苷酸具有82%的同源性[3],主要含有6个功能性开放阅读框(open reading frame, ORF)/蛋白编码区:ORF1a/b、S、E、M、N[3](图1)。SARS-CoV-2侵入人体宿主细胞的方式与人SARS-CoV一致,由细胞膜上血管紧张素转换酶2 (ACE2)受体介导[4],ACE2受体广泛存在于口腔、呼吸道和结肠等部位的黏膜细胞,因此无防护措施下与外界环境相通的口腔、呼吸道、眼睑等部位极易因暴露而感染[5]。

此次COVID-19潜伏期较长、传染性强,疫情爆发期间亟需开发快速、准确、简便的诊断技术,早确诊、早隔离、早治疗可帮助病人被尽早治愈。初期研究人员通过高通量测序技术最先检出病毒并将其作为确诊途径[6],但该技术成本高且费时,不满足大规模检测的需求,而核酸检测技术具有高灵敏、高特异、结果可定量等优势,为COVID-19的确诊及疫情防控提供了极大帮助,截至2020年8月17日,国家药品监督管理局应急批准的23个新型冠状病毒检测产品中囊括了15个核酸检测试剂盒。本文主要综述了目前国内SARS-CoV-2核酸检测技术的研究进展及应用现状,以期为COVID-19的快速筛查、确诊提供更多的方案思路,同时提高公共卫生领域对COVID-19等传染性疾病的防控能力。

1 逆转录—实时荧光定量PCR (RT- qPCR)核酸检测技术

美国生物化学家Kary Mullis于1985年首次提出聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术——一种在体外扩增特异DNA片段的技术[7]。SARS-CoV-2为RNA病毒,需先将目标片段逆转录为cDNA再进行PCR扩增,首先针对目标片段设计一对上下游引物,在DNA聚合酶的作用下,通过热变性、退火、延伸等步骤按照半保留复制的机制完成新的DNA合成,新合成的DNA也可以作为模板,不断重复这一过程,目标片段的合成量将呈指数级增长。实时荧光定量PCR技术在普通PCR技术的基础上增加了化学发光物质,最常用的为TaqMan探针法,原理如图2所示,探针的5ʹ端标记荧光基团,3ʹ端标记淬灭基团,在荧光谐振能量传递(fluo­rescence resonance energy transfer, FRET)效应下,荧光呈现淬灭状态。当目标片段扩增时,酶对探针进行切割,荧光基团远离淬灭基团,发出荧光,利用专门仪器测定荧光到达一定阈值所需的循环数(值)即可对初始模板进行精确定量。

由于RNA病毒容易发生变异,RT-qPCR技术用于检测SARS-CoV-2时一般会在ORF1ab、S、N、E 等基因中选取多个靶标进行检测,防止出现漏检错检,从而提高检测准确度。RT-qPCR技术可以高灵敏、高特异地完成SARS-CoV-2的检测,易于在临床上推广普及,成为《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中首推的检测方法[8]。截至2020年8月17日,国家药监局已应急批准10个以RT-qPCR技术为主要原理的核酸检测试剂盒,其中大部分试剂盒选择SARS-CoV-2的多个基因作为检测靶标,以提高检测准确率。

然而,在临床实际诊断过程中,出现了RT-qPCR检测结果为假阳性及假阴性的问题,分析产生假阳性的原因如下:(1)样本转运、提取过程中被污染;(2)引物设计不当产生非特异性扩增;(3)阈值设置过低导致假阳性判读结果;而产生假阴性的原因如下:(1)病毒基因组变异,影响与原先设计引物/探针的结合;(2)感染早期,采样部位所含病毒量低于检测限;(3)样本转运、保存过程不规范;(4)检测人员操作不当、仪器设备等因素;(5)试剂存在质量问题或者不同试剂盒提取扩增效率不一致;(6)阈值设置过高导致假阴性判读结果。据报道,目前RT-qPCR技术检测SARS-CoV-2感染的准确率仅达到30%~50%[9],因此亟需研究开发出准确度更高、效果更好的核酸检测技术。

2 非RT-qPCR核酸检测技术

目前针对SARS-CoV-2的核酸检测大多通过RT-qPCR技术进行,由于需要专业的技术人员及精密的温控设备,不断升降温导致反应时间过长,检测速度较慢且存在假阳性及假阴性问题,世界卫生组织已于2020年2月明确指出“开发准确并且使用简便的检测方法是当务之急”。我国国家药品监督管理局为进一步满足疫情防控的需求,已应急批准以下5种原理不同于RT-qPCR技术的核酸检测试剂盒,各试剂盒所使用的检测技术和靶标如表1所示。

图1 SARS-CoV-2基因组结构模式及常见的引物扩增位置

橙色位置为扩增片段扩增位置。

图2 实时荧光定量PCR技术(TaqMan探针法)原理

2.1 恒温扩增芯片技术

相比于需要不断升降温的RT-qPCR技术,核酸恒温扩增技术在恒定温度下即可进行扩增反应,操作简单、快速、性价比高,且灵敏度和特异性与PCR反应相当。环介导的恒温扩增技术[10~12](loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增技术,其原理是针对目标基因的6个区域设计4种特异性引物,利用链置换DNA聚合酶在等温条件(63 ℃左右)下保温30~60 min,即可完成核酸扩增反应,具体原理如图3所示。

成都博奥晶芯生物科技有限公司在2019年通过将LAMP恒温扩增技术与蝶式微流控技术相结合[13,14],实现同时检测6种猪病毒的目的,在此研究基础上,该公司设计出全球首个能在1.5 h内检测包括SARS-CoV-2、甲型流感病毒、新型甲型H1N1流感病毒(2009)、甲型H3N2流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒共6项呼吸道病毒的核酸检测芯片试剂盒,通过荧光进行实时检测。此前的SARS- CoV-2核酸检测产品均只能针对SARS-CoV-2单一指标进行检测,而该试剂盒可以针对多个靶标实现多重检测,能够有效快速地区分普通流感患者与COVID-19患者,为临床上大量的疑似感染患者提供更加简便快速的诊断,实现精准诊断、精准治疗。

综合对比LAMP恒温扩增技术与蝶式微流控技术,恒温扩增芯片技术步骤简单、扩增高效、有较高的灵敏度及特异性、样品用量少,利用微流控分区可对多项指标同时进行检测,有效降低医务人员感染的风险。但是该技术没有将核酸提取步骤与扩增、检测流程集成,仍需依靠其他设备或人工提取病毒核酸,并未完全实现“样本进、结果出”的集成化和全自动化。

2.2 SAT-RNA实时荧光恒温扩增技术

SARS-CoV-2检测存在的“假阴性”问题与样本采集、保存运输、预处理、核酸提取、扩增检测等过程息息相关,提取出高质量的病毒核酸可有效改善这一问题。SARS-CoV-2为RNA病毒,传统的滤膜吸附洗脱提取会损失部分样本,特异性靶标捕获技术(磁珠法) (specific target capture technology (mag­netic bead method))[15]可以提取到高纯度RNA,通过在磁珠表面标记Oligo (dT),与含有互补Oligo (dA)的特异性捕获核酸配对结合,若样本中存在待测靶标,捕获探针将会与其互补配对,最终利用磁铁吸附磁珠,可特异性提取出待测靶标,原理如图4所示。

上海仁度生物科技有限公司采用独特的样本保存液对RNA病毒样本进行常温保存,减少样本损失,然后通过特异性靶标捕获技术以及SAT-RNA实时荧光恒温扩增技术(simultaneous amplification and testing-RNA technology)开发了高通量、全自动一体化的SARS-CoV-2检测平台(Auto-SAT新冠自动检测平台)。在42 ℃恒温条件下,靶标RNA在M-MLV逆转录酶的作用下合成带T7启动子的双链cDNA,T7 RNA聚合酶以该双链DNA为模板进行转录,每个cDNA分子可以转录出100~1000拷贝的RNA,合成的RNA与分子信标结合,释放出荧光,通过高分辨率的分子信标检测技术来监控扩增循环情况,可完全实现“样本进、结果出”的自动化检测,具体原理如图5所示。

表1 国家药品监督管理局批准的非RT-qPCR技术的新型冠状病毒核酸检测试剂盒

图3 环介导等温扩增(LAMP)技术原理

A:LAMP外部引物F3/B3和内部引物FIP/BIP与靶标的6个区域互补;B:恒温扩增过程。

与国内其他快速分子诊断平台相比,该平台有更高的检测灵敏度、准确度及特异性,采用双靶标/双内标分管模式进行独立检测,一次性放置80个样本并实现连续上样,做到病毒核酸提取纯化、扩增检测、结果报告的全程一体化。整个检测过程在密闭环境内进行,保证了实验的生物安全性,降低了检测人员的感染风险,且全流程标准化操作,无需人工干涉,可排除人为因素引起的结果偏差。

图4 特异性靶标捕获技术(磁珠法)原理

同时检测多个样本时,Auto-SAT新冠自动检测平台90 min后给出第一个结果,后续每10 min出6个结果,24 h即可检测700个样本[16],适合对大批量样本进行筛查。虽然该平台展现出大通量检测的差异性优势,但需要昂贵的大型设备,若只需要检测少量样本,则会导致平均检测费用较高。同时SAT恒温扩增检测技术由于循环过程复杂,需重复加入多种酶,造成试剂成本相对较高,不适合在疫情一线进行快速现场检测。

2.3 交叉引物恒温扩增—实时荧光技术

在某些疫情一线地区没有专门的生物安全实验室及专业检测人员,无法对SARS-CoV-2进行快速检测,杭州优思达生物技术有限公司利用交叉引物恒温扩增技术[17](cross priming amplification, CPA)以及试剂玻璃化技术开发了EasyNAT 新型冠状病毒核酸检测试剂盒。试剂运输过程无需冷链,配套使用全自动CPA核酸分析仪,能够快速准确地检测样本中的SARS-CoV-2,实现诊断关口前移,确保更好地防控和治疗。该产品已在浙江大学医学院附属第一医院进行了60例临床验证,其临床灵敏度达100%、特异性达100%,优于对照的PCR试剂盒[18]。

图5 SAT-RNA实时荧光恒温扩增检测技术

CPA技术共需要设计两对引物:交叉扩增引物和外围置换引物[19,20]。将RNA病毒逆转录为cDNA样本后,交叉扩增引物与cDNA中的互补区域结合,在Bst DNA聚合酶的作用下合成双链DNA,外围置换引物与cDNA的前端序列互补,一边与cDNA形成双链结构一边置换交叉扩增引物合成的单链产物,最终形成两端带有交叉引物结合位点的单链扩增产物。随着交叉扩增引物的不断杂交和延伸,分支状扩增产物的拷贝数不断增加,体系里含有的荧光探针与其结合后发出荧光,可达到实时检测的目的,主要原理如图6所示。

图6 交叉引物恒温扩增技术原理

A:带有交叉引物位点的扩增产物的产生;B:交叉引物扩增最终生成分支状产物。

SARS-CoV-2具有较高的传染性,全自动CPA核酸分析仪只需将样本加入密闭的独立检测管,放入仪器中即可快速进行反应,无接触感染风险,极大地保障了医护及检测人员安全。全自动“傻瓜式”操作可以实现“样本进、结果出”,对检测人员的技能要求低。该技术能够快速、方便、准确地对SARS-CoV-2核酸进行检测,尤其适用于疫情一线配置薄弱的生物检测实验室,但该仪器一次只能检测两个样本,不适合用于疫情严重地区的大规模检测筛查。

2.4 杂交捕获免疫荧光技术

上述几种方法均需配备专门的检测设备,无法实现仪器小型化、操作简单化、报告结果即时化的现场快速检测,导致COVID-19的确诊周期较长。安邦(厦门)生物科技有限公司基于2019年公开的核酸杂交捕获免疫荧光技术[21]开发了新型冠状病毒核酸检测试剂盒,该技术无需提取纯化SARS-CoV-2核酸,无需进行PCR扩增,利用处理液直接裂解病原体并释放靶核酸,反转录为cDNA后,设计能与该核酸片段杂交的探针来捕获待测样本中的靶核酸,形成RNA/DNA双链杂交体,该杂交体在免疫荧光层析试纸条上的加样区与荧光素标记第一捕获抗体结合,通过毛细管作用到达检测区与第二捕获抗体结合形成三元复合物,恒温反应45 min左右对该复合物进行荧光信号识别,可对样本中SARS-CoV-2的核酸实现现场快速检测,主要原理如图7所示。

杂交捕获免疫荧光技术是一种新型的快速分子诊断技术,一步即可快速检测病毒、操作简单、试剂盒所需组分常温条件下即可储存运输、检测仪器方便携带、无需专业人员及PCR实验室,一台仪器一小时最多可测试60份样本,可实现随到随检的现场快速检测且不会引起实验室阳性产物污染。该试剂盒已在3家临床单位完成670例临床试验,临床灵敏度88.61%,临床特异性94.92%,总体符合率达92.69%[22]。

图7 杂交捕获免疫荧光技术原理

但是该技术只能给出定性结果,无法精确定量;检测限为500拷贝/mL,灵敏度较低;且不适合用于检测咽部2 h内用药的病人。同时不合理的样本采集、转运及处理、样本中病毒含量过低、待检病原体探针结合位点的较大变异均有可能导致假阴性结果,另外临床数据也显示不同病程不同阶段样本的阳性率存在不一致的情况。

2.5 联合探针锚定聚合测序技术

在抗“疫”前线,高通量测序仪可快速助力未知病原体的鉴定。疫情初期,正是高通量测序第一时间帮助科研人员获得了SARS-CoV-2的全基因组序列[23]。华大生物科技(武汉)有限公司以联合探针锚定聚合测序技术为原理设计了SARS-CoV-2核酸检测试剂盒,这一技术的具体细节尚未完全公布。主要步骤如下:首先对样本进行DNA提取并片段化处理,对DNA片段末端进行修复并加上接头序列,利用DNA纳米球技术扩增,DNA分子锚和荧光探针在DNA纳米球上聚合,此过程可通过该公司的自动化样本制备工作站MGISP系列完成,随后利用MGIDL-T7全自动样本加载系统将DNA纳米球加载到载片上以完成测序载片的制备,DNBSEQ-T7高通量测序仪对载片上DNA纳米球产生的光信号进行采集分析,读取碱基信息并给出测序结果。

联合探针锚定聚合测序技术在DNBSEQ-T7高通量测序仪的帮助下能够获得特定的病毒基因组序列,即使病毒基因组序列产生变异,也不影响对整体同源性的比对。该技术可以对核酸检测呈阴性但临床症状疑似感染的患者提供复检及混合感染诊断等帮助,同时可对病毒序列提供持续监测,方便科研人员对病毒变异进行研究。

联合探针锚定聚合测序技术通过全自动化平台可对SARS-CoV-2实现快速高效的核酸检测,灵敏度高、不易漏诊错诊、对操作人员要求较低。但其结果也易受多种因素影响,如:(1)未规范保存样本、未及时检测样本导致的错检;(2)检测环境温度过高对结果判读的影响等。

3 结语与展望

目前我国新型冠状病毒肺炎疫情已得到较好的控制,局部地区出现的反弹现象能得到及时处理,武汉等地区大范围的筛查工作也有序展开,但每天仍有数例境外输入病例及无症状感染者,个人防护仍需重视。目前针对新型冠状病毒肺炎最有效的防治措施仍是早确诊、早隔离、早治疗,这需要快速、准确、简便的检测技术支持。除了新冠病毒的核酸检测技术,国家药品监督管理局还批准了8个新冠病毒特异性抗体检测试剂盒,主要为IgM和IgG两类。IgM抗体在免疫应答中首先分泌,一经感染快速产生,但维持时间短,只适合诊断早期感染;IgG抗体属于记忆性抗体,在机体再次产生免疫应答时产生,产生时间较晚,维持时间长,可提高诊断准确性。该类基于血清学的检测方法无需特殊仪器、用时短,适合对大规模人群进行初步筛查,但检测灵敏度及特异性与机体感染时长密切相关,对潜伏期及感染初期的病例容易漏诊,因此不适合作为COVID-19确诊和排除的单一途径,临床诊断标准仍需以核酸检测结果为主要参考。

本文针对国内SARS-CoV-2核酸检测的分子诊断新技术作了简单综述,高灵敏、高特异、可定量的RT-qPCR技术是临床诊断的“金标准”,使用高质量试剂盒、提高操作熟练度可减少假阳性及假阴性问题,该技术仍然是临床上最为广泛使用的技术;由于普通流感与COVID-19的初期症状相似,恒温扩增芯片技术可同时检测6种呼吸道病毒,快速诊断或排除疑似感染患者,减少医院内的交叉感染;联合探针锚定聚合测序技术和SAT-RNA实时荧光恒温扩增技术通量大,能实现全自动化检测,适合对大范围样本进行筛查,且前者可监测病毒突变;交叉引物恒温扩增——实时荧光技术虽可实现全自动化,但通量小,适合在疫情一线地区进行快速检测;杂交捕获免疫荧光技术所需仪器方便携带,检测过程快速简便,能够满足随到随检的现场即时检测(point-of-care testing, POCT)。本文介绍的每一种方法各有其优缺点(表2),可根据检测人群及检测目的的不同选择合适的检测方法。

随着科学技术的不断发展,研究人员也在不断开发更多用于临床检测的分子诊断新技术,如微滴式数字化PCR(droplet digital PCR, ddPCR)技术[24,25]、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase ampli­fication, RPA)技术[26]、基于CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13系统的核酸检测技术[27,28]等。ddPCR技术将水相溶液样本封装为数万个纳升体积大小的微液滴,经过PCR扩增后,含有待测靶标的微液滴产生荧光信号,无需标准品即可实现绝对定量。该技术检测灵敏度高,在低病毒载量的样本检测中更有优势且能给出样本中的病毒载量数值。目前已有公司开发出试剂盒,检测下限低至3拷贝/反应,但只限于科研使用,若该技术获得批准用于临床诊断,可对微量病毒携带者进行筛查,大大降低漏检率及错检率。RPA技术被认为是可以替代PCR的核酸等温扩增技术,该技术在37 ℃左右依赖重组酶的链置换活性即可对模板进行扩增,反应迅速且灵敏度与PCR相当,目前尚无将RPA技术单独用于检测SARS-CoV-2的报道,但张锋团队[29]将其与CRISPR-Cas13偶联,开发出SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking)技术,利用CRISPR-Cas13a在向导序列的介导下与靶标结合时被激活的附属无特异性的RNA酶活性,切割体系中的单链RNA报告探针,发出荧光,实现特异性检测,灵敏度可达10拷贝/反应。未来高灵敏度、高特异性、可定量、用时短、可携带的多重检测将成为分子诊断新技术的研究重点,为临床预防及控制传染病提供更加快捷准确的诊断方式。

表2 临床SARS-CoV-2核酸检测的分子诊断技术总结对比

“−”:暂未公布具体数据。

[1] Zhou P, Yang XL, Wang XG, Hu B, Zhang L, Zhang W, Si HR, Zhu Y, Li B, Huang CL, Chen HD, Chen J, Luo Y, Guo H, Jiang RD, Liu MQ, Chen Y, Shen XR, Wang X, Zheng XS, Zhao K, Chen QJ, Deng F, Liu LL, Yan B, Zhang FX, Wang YY, Xiao GF, Shi ZL. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin., 2020, 579(7798): 270–273.

[2] Wang C, Horby PW, Hayden FG, Gao GF. A novel coronavirus outbreak of global health concern., 2020, 395(10223): 470–473.

[3] Chan JFW, Kok KH, Zhu Z, Chu H, To KKW, Yuan SF, Yuen KY. Genomic characterization of the 2019 novel human-pathogenic coronavirus isolated from a patient with atypical pneumonia after visiting Wuhan., 2020, 9(1): 221–236.

[4] Lu RJ, Zhao X, Li J, Niu PH, Yang B, Wu HL, Wang WL, Song H, Huang BY, Zhu N, Bi YH, Ma XJ, Zhan FX, Wang L, Hu T, Zhou H, Hu ZH, Zhou WM, Zhao L, Chen J, Meng Y, Wang J, Lin Y, Yuan JY, Xie ZH, Ma JM, Liu WJ, Wang DY, Xu WB, Holmes EC, Gao GF, Wu GZ, Chen WJ, Shi WF, Tan WJ. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding., 2020, 395(10224): 565–574.

[5] Hoffmann M, Kleine-Weber H, Schroeder S, Krüger N, Herrler T, Erichsen S, Schiergens TS, Herrler G, Wu NH, Nitsche A, Müller MA, Drosten C, Pöhlmann S. SARS- CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor., 2020, 181(2): 271–280.e8.

[6] Zhu N, Zhang DY, Wang WL, Li XW, Yang B, Song JD, Zhao X, Huang BY, Shi WF, Lu RJ, Niu PH, Zhan FX, Ma XJ, Wang DY, Xu WB, Wu GZ, Gao GF, Tan WJ. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019., 2020, 382(8): 727–733.

[7] Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Enzymatic amplification of beta- globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia., 1985, 230(4732): 1350–1354.

[8] General Office of National Health Commission of the People's Republic of China, Office of National Admini­stration of Traditional Chinese Medicine. Diagnosis and treatment of corona virus disease-19(7th trial edition)., 2020, 15(6): 801–805.中华人民共和国国家卫生健康委员会办公厅, 国家中医药管理局办公室. 新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版). 中国医药, 2020, 15(6): 801–805.

[9] Xu JH, Wang SL, Zhang SX, Lai GX, Lan XP, Wu XL, Yu ZY. Methods for nucleic acid detection of 2019 novel coronavirus.2020, 3: 1–19.许金和, 王水良, 张胜行, 赖国祥, 兰小鹏, 吴小丽, 余宗阳. 新型冠状病毒核酸检测方法. 国际检验医学杂志, 2020, 3: 1–19.

[10] Craighead H. Future lab-on-a-chip technologies for inter­rogating individual molecules., 2006, 442(7101): 387–393.

[11] Wu JD, Dong ML, Santos S, Rigatto C, Liu Y, Lin F. Lab- on-a-chip platforms for detection of cardiovascular disease and cancer biomarkers., 2017, 17(12): 2394.

[12] He XP, Zou BJ, Qi XM, Chen S, Lu Y, Huang Q, Zhou GH. Methods of isothermal nucleic acid amplification-based microfluidic chips for pathogen microorganism detection., 2019, 41(7): 611–624.何祥鹏, 邹秉杰, 齐谢敏, 陈杉, 陆妍, 黄青, 周国华. 基于核酸等温扩增的病原微生物微流控检测技术. 遗传, 2019, 41(7): 611–624.

[13] Yuan XF, Lv JZ, Lin XM, Zhang CY, Deng JH, Wang CX, Fan XP, Wang YG, Xu H, Wu SQ. Multiplex detection of six swine viruses on an integrated centrifugal disk using loop-mediated isothermal amplification., 2019, 31(3): 415–425.

[14] Yan H, Zhu YZ, Zhang Y, Wang L, Chen JG, Lu Y, Xu YC, Xing WL. Multiplex detection of bacteria on an integrated centrifugal disk using bead-beating lysis and loop-mediated amplification., 2017, 7(1): 1460.

[15] 刘伟. 基于RNA靶标SAT解脲脲原体感染分子生物学检测方法. CN108611403A, 2018-10-02.

[16] 高通量、全流程一体化的新冠核酸检测平台. http://www. rdbio.com/gongsidongtai/122.html, 2020-03-29.

[17] Fang RD, Li X, Hu L, You QM, Li J, Wu J, Xu P, Zhong HY, Luo Y, Mei J, Gao Q. Cross-priming amplification for rapid detection of mycobacterium tuberculosis in sputum specimens., 2009, 47(3): 845–847.

[18] 杭州一企业紧急研制新冠病毒核酸检测试剂盒最快30分钟出结果. https://ori.hangzhou.com.cn/ornews/content/ 2020-01/31/content_7668258.htm, 2020-01-31.

[19] You QM. Cross priming amplification of target nucleic acids. CA2748822, 2016-09-06-18.

[20] 祁军, 尤其敏, 柴宏森, 左锋, 王馨, 詹曦菁, 刘振宇, 刘寅, 杨春江, 刘智勇, 徐高连, 刘启军, 张霞, 崔景柏, 王宏莹, 高秋萍, 吴汀滢. 运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测肠出血性大肠埃希菌的试剂及其扩增方法和检测方法. CN102363816A, 2012-02-29.

[21] 汪大明, 钟乾兴, 胡啸, 张利伟, 肖江群, 王保丹, 江应玲, 乐宜萃. 一种核酸杂交捕获免疫荧光检测方法、免疫荧光层析试条及试剂盒. CN109613236A, 2019-04-12.

[22] 新型冠状病毒核酸–安邦(厦门)生物科技有限公司. http://www.anbio.com/products_info.asp?id=54, 2020-03.

[23] 一文读懂测序技术在新冠病毒检测中的应用. https:// www.medsci.cn/article/show_article.do?id=5d4419098e46, 2020-03-27.

[24] Guo Z, Wang F, Guo YX, Liu XW, Yang XG, Song YF, Wang DG. Potential value of droplet digital PCR in detection of SARS-CoV-2.. 2020, 46(02): 14–18.郭兆, 王芳, 郭妍譞, 刘向文, 杨旭光, 宋焱峰, 王德贵. 微滴式数字PCR技术在新型冠状病毒检测中的潜在价值. 兰州大学学报(医学版), 2020, 46(2): 14–18.

[25] Yu FT, Yan LT, Wang N, Yang SY, Wang LH, Tang YX, Gao GJ, Wang S, Ma CJ, Xie RM, Wang F, Tan C, Zhu LX, Guo Y, Zhang FJ. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients., 2020, 71(15): 793–798.

[26] Wahed AAE, Patel P, Heidenreich D, Hufert FT, Weidmann M. Reverse transcription recombinase polymerase amp­lification assay for the detection of middle east respiratory syndrome coronavirus., 2013, 5(8): 813–818.

[27] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, Essletzbichler P, Dy AJ, Joung J, Verdine V, Donghia N, Daringer NM, Freije CA, Myhrvold C, Bhattacharyya RP, Livny J, Regev A, Koonin EV, Hung DT, Sabeti PC, Collins JJ, Zhang F. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2., 2017, 356(6336): 438–442.

[28] Wang XJ, Zhong MT, Liu Y, Ma PX, Dang L, Meng QZ, Wan WW, Ma XD, Liu J, Yang G, Yang ZF, Huang XX, Liu M. Rapid and sensitive detection of COVID-19 using CRISPR/Cas12a-based detection with naked eye readout, CRISPR/Cas12a-NER., 2020, 65(17): 1436–1439.

[29] Enabling coronavirus detection using CRISPR-Cas13: Open-access SHERLOCK research protocols and design resources | Broad Institute. https://www.broadinstitute.org/ news/enabling-coronavirus-detection-using-crispr-cas13-open-access-sherlock-research-protocols-and, 2020-03-15.

New molecular diagnostic technologies for clinical detection of SARS-CoV-2

Chunmei Xie1, Haiping Wu1, Xueping Ma1, Guohua Zhou1,2

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) has caused an ongoing pandemic of new coronavirus pneumonia (corona virus disease 2019, COVID-19). The virus has a long incubation period and strong infectivity, which poses a major threat to global health and safety. Detection of SARS-CoV-2 nucleic acid lies at the center of rapid detection of COVID-19, which is instrumental for mitigation of the ongoing pandemic. As of August 17, 2020, The National Medical Products Administration in China has approved 15 new coronavirus nucleic acid detection kits, 10 kits of which are based on reverse transcription-real-time quantitative PCR (RT-qPCR) technology. The remaining kits use five molecular diagnostic technologies different from RT-qPCR. This article reviews the principles, reaction time, advantages and disadvantages of above 15 detection kits, in order to provide references for rapid screening, diagnosis, prevention and control of COVID-19 and similar infectious diseases.

novel coronavirus; nucleic acid detection; molecular diagnostic technology

2020-06-22;

2020-08-19

国家自然科学基金项目(编号:61871403)和江苏省杰出青年基金项目(编号:BK20180005)资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.61871403), and Jiangsu Provincial Science Fund for Distinguished Young Scholars (No. BK20180005)]

谢春梅,在读硕士研究生,专业方向:分子诊断。E-mail: 15151868313@163.com

周国华,博士,研究员,研究方向:分子诊断。E-mail: ghzhou@nju.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-189

2020/9/10 7:18:21

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200908.1130.002.html

(责任编委: 谢建平)

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