外源性H2S对糖尿病大鼠晶状体透明度的影响及其作用机制△

房城 郑秀茜 刘永武 赵良友 严妍 姜波 焦月华 刘树民

糖尿病性白内障是糖尿病的常见并发症，几乎所有的1型糖尿病患者和80%左右的2型糖尿病患者都会发生糖尿病性白内障[1-2]。糖尿病性白内障已经成为糖尿病患者致盲的主要原因[3]。糖尿病患者白内障发病率是非糖尿病患者的3～5倍[4]。

研究人员发现，H2S是与NO和CO有相似生物学特性的第3种气体分子[5]。催化内源性H2S生成的酶主要是5-磷酸吡哆醛依赖性酶，包括胱硫醚-β-合成酶、胱硫醚-γ-裂解酶[6]。H2S在抗炎、抗氧化等方面具有重要的作用[7]。糖尿病患者体内TNF-α表达增加，TNF-α是引发糖尿病相关并发症的关键因素[8]。TNF-α通过旁分泌的方式影响胰岛素分泌，并且能够减少晚期糖基化终末产物(AGEs)的生成[8]。白内障的发生与炎症反应和AGEs在晶状体中聚集过多有关[9]。研究发现，H2S能减少糖尿病患者伤口组织中TNF-α生成[10]。本研究探讨外源性H2S对糖尿病大鼠晶状体透明度的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验对象、仪器及试剂取SPF级健康雄性SD大鼠15只作为实验对象，体质量200～220 g(由黑龙江中医药大学动物中心提供；动物质量合格证：201502579)。主要实验试剂及仪器包括：链脲佐菌素、NaHS(美国Sigma公司)，血糖仪及血糖试纸(中国鱼跃医疗股份有限公司)，ELISA检测试剂盒(上海酶远生物科技有限公司)。

1.2 糖尿病模型大鼠制备及动物分组将大鼠饲养1周后，腹腔注射链脲佐菌素(50 mg·kg-1)。监测大鼠造模72 h血糖浓度(当血糖浓度大于16.7 mmol·L-1时，认定为造模成功)。按随机数字表法将大鼠随机分为3组，对照组(正常大鼠)、模型组(糖尿病模型大鼠)、治疗组(糖尿病模型大鼠+NaHS处理)，每组5只。造模后，治疗组大鼠每天上午腹腔注射NaHS(5 mg·kg-1)1次，对照组和模型组给予相同体积生理盐水，连续给药12周。本研究遵循《实验动物管理条例》(2017修订版)的规定。

1.3 晶状体透明度观察和ELISA检测给药12周末，将SD大鼠麻醉后取出眼球，将晶状体剥离出来，放置在田字格十字交叉处观察晶状体透明度。将剥离的晶状体用蛋白提取试剂盒提取蛋白后，按ELISA试剂盒操作，用纯化的大鼠TNF-α、AGEs抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被抗体的孔中依次加入TNF-α、AGEs，再与辣根过氧化物酶标记的TNF-α、AGEs抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经彻底洗涤后加底物四甲基联苯胺显色。用酶标仪在450 nm波长处测定光密度(D)值，依据标准曲线计算样品中大鼠TNF-α、AGEs浓度。

1.4 统计学处理应用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，采用单因素方差分析各组数据，偏态分布数据比较采用秩和检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组晶状体透明度观察结果给药12周后，对照组大鼠晶状体透明度良好，能够清晰看到十字交叉。模型组晶状体明显混浊，看不到十字交叉。治疗组晶状体与对照组相比，出现轻微的混浊，但与模型组相比，晶状体相对透明(见图1)。

图1 各组晶状体透明度的变化A：对照组；B：模型组；C：治疗组

2.2 各组大鼠晶状体组织中TNF-α和AGEs浓度变化ELISA检测结果显示：模型组TNF-α和AGEs浓度均高于对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；治疗组TNF-α和AGEs浓度均低于模型组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见表1)。

表1 各组大鼠晶状体组织中TNF-α和AGEs浓度变化

3 讨论

社会发展、人口老龄化、肥胖人口增长等因素促使糖尿病的发病率逐年升高[11]，而白内障是糖尿病的早期并发症之一。目前，对于糖尿病性白内障的发病机制尚不完全清楚，临床上也缺乏能够彻底治疗白内障的特效药物。因此，研究糖尿病性白内障的发病机制，对糖尿病性白内障的治疗和药物研发具有重要的临床意义。

白内障是由晶状体混浊所导致的视觉缺陷，影响眼睛的聚光和清晰成像。根据世界卫生组织报告，白内障患者数已经远远超过青光眼和老年性黄斑变性，成为致盲的主要疾病[12]。研究表明，TNF-α是导致糖尿病性白内障的关键因素，TNF-α水平增高会导致糖尿病性白内障[13]；另有研究表明，在2型糖尿病大鼠实验中，H2S可以减少伤口TNF-α的生成，从而减轻炎症反应，促进伤口愈合[10,14-16]；本研究利用腹腔注射链脲佐菌素的方法建立糖尿病大鼠模型，模型组大鼠晶状体中TNF-α的表达高于对照组，治疗组低于模型组，这与以往的研究结果类似[13-15]。AGEs在糖尿病性白内障晶状体混浊中起关键作用[17]。AGEs在晶状体中聚集是晶状体出现混浊的主要原因，也是导致白内障的重要发病因素[18]。AGEs的升高使结构蛋白发生不可逆性改变，在晶状体中蛋白积聚和高聚合物产生过多会引起视力异常[19]。本研究模型组大鼠晶状体组织中AGEs的表达高于对照组；治疗组大鼠晶状体组织中AGEs的表达低于模型组。

综上所述，本研究认为，TNF-α、AGEs信号通路参与了糖尿病性白内障病理改变的发生与发展，而外源性H2S可以抑制糖尿病大鼠晶状体组织中TNF-α、AGEs的表达，从而提高糖尿病大鼠晶状体透明度。