大黄酚与转化生长因子-β1对体外培养人成纤维细胞胶原及盘状结构域受体2的调控作用及机制

杨成华 巫岳龙 李敏 程基焱 颜丽萍

(1达州职业技术学院，四川 达州 635001；2西南医科大学；3泰安护理职业技术学院)

成纤维细胞参与修复的整个过程，其分裂、增殖、迁移、合成与分泌细胞外基质，形成结缔组织或瘢痕组织、使创伤修复，这是目前医学理论中组织创伤后修复的主要机制〔1～3〕。细胞外基质中，胶原是最为重要的有形成分，目前已经发现的胶原至少有10多种类型，其中Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)是最主要成分，是成纤维细胞修复组织创伤过程中的主要角色。研究发现，胶原纤维可以激活盘状结构域受体(DDR)2，再通过作用于基质金属蛋白酶(MMPs)降解胶原参与胶原的合成与分泌及细胞外基质重构〔4,5〕。大黄酚是大黄、芦荟等多种中药的有效成分。大黄、芦荟在中国的使用有着悠久的历史，除了可以用于疾病的辨证施治以外，还用于保健和日用化工品中，对于护发和护肤方面的应用尤为常见〔6～8〕。本研究采用体外培养人成纤维细胞，用大黄酚干扰，检测成纤维细胞的增殖及对Col-I、Col-Ⅲ、DDR2表达的影响，探讨大黄酚对成纤维细胞的影响及机制，为成纤维细胞的功能调控的研究及中药大黄、芦荟在临床的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1细胞来源及主要试剂、设备 人成纤维细胞细胞株：北纳生物公司；一抗(胶原、DDR2)：上海信裕生物科技有限公司；Western印迹和聚合酶链反应(PCR)试剂盒：大黄酚：上海宝曼生物科技有限公司；天根生化科技(北京)有限公司；流式细胞仪：美国BD公司。

1.2细胞培养及干扰 将人成纤维细胞株复苏，用1.0×105/L的细胞浓度接种到培养板，小牛血清10%和DMEM培养基常规培养，待3～4 d后增殖到约70%后换用无血清成纤维细胞培养基培养24 h后进行后续干扰。细胞分为对照组(CG)、TGF组(TTG)、大黄酚组(CTG)。CG常规培养，TTG以5 μg/ml的TGF-β1干扰，CTG分别以二甲基亚砜为溶剂溶解大黄酚稀释，以200 μg/ml干扰，24 h后终止干扰，进入后续使用。

1.3实时定量(qRT)-PCR检测DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的mRNA表达水平 细胞干扰培养48 h后收集细胞，提取细胞总RNA，计算RNA溶液浓度。然后逆转录合成cDNA，冰上冷却，逆转录，-20℃保存cDNA。PCR条件：95℃ 30 s 1个循环；60℃ 60 s，40个循环；最后65℃ 15 s。以β-actin作为内参，进行相对定量分析。采用分析软件Bio.Rad CFXManager自动统计和计算。引物设计：DDR2正义5′-GCAACACGTAGAACTCTACCAGAA-3′，反义5′-CAGCCACTCAGGCGTATCA-3′；Col-Ⅰ正义5′-TGCCGTGACGTGAAGATGTG-3′，反义5′-CACAAGCGTGCTGTAGGTGA-3′；Col-Ⅲ正义5′-ATGGTGGCTTTCAGTTCAGC-3′，反义5′-TGGGGTTTCAGA GAGTTTGG-3′。

1.4Western印迹检测DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达水平 细胞干扰培养48 h后洗涤、收集培养细胞，细胞裂解液4℃，30 min下裂解细胞，移至离心管，4℃ 12 000 r/min，离心5 min，收集上清，-20℃保存。根据试剂盒说明书配制蛋白标准品，酶标仪下波长562 nm比色绘制标准曲线。置样品放于96孔板，加二喹啉甲酸(BCA)工作液，酶标仪下波长562 nm比色并记录各孔吸光值，在标准曲线上查得相应蛋白含量。聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳，浓缩胶电泳电流为25 mA，分离胶电泳电流为30 mA，将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%去脂牛奶封闭，一抗分别与磷酸盐缓冲液(PBS)、0.1% Tween-20和5% 去脂牛奶混合，膜放入该混合液中4℃过夜，洗涤后加入二抗，室温孵育2 h，充分洗涤，曝光，显影并拍照。Quantity-one软件分析灰度值，以目的片段的灰度值与相应β-actin灰度值的比作为蛋白质的相对水平。抗体稀释度：DDR2(1∶500稀释)，Col-Ⅰ(1∶400稀释)，Col-Ⅲ(1∶500稀释)，二抗(山羊抗小鼠，1∶5 000稀释；山羊抗兔，1∶5 000稀释)。

1.5流式细胞仪检测细胞周期 取干扰24 h后的细胞，胰酶消化，离心后冰乙醇固定。采用5×105/ml的细胞浓度，再用碘化丙啶(PI)染液孵育染色。流式细胞仪(美国 BD公司，型号BD CSCalibur)下，用488 nm波长激光激发，AC Station、Cell QUEST Pro进行细胞周期检测。

1.6统计学检验 采用Graph Pad Prism软件进行t检验。

2 结 果

2.1qRT-PCR检测DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的mRNA表达水平 与CG(1.00)比较，TTG、CTG上调成纤维细胞的DDR2 mRNA表达(1.21、1.24)，有显著性差异(P<0.05)；与CG(1.00)比较，TTG上调成纤维细胞的Col-Ⅰ表达(1.29)，有显著性差异(P<0.05)；CTG下调成纤维细胞的Col-Ⅰ表达(0.91)，有显著性差异(P<0.05)；与CG(1.00)比较，TTG略微下调成纤维细胞的Col-Ⅲ表达(0.95)，无显著性差异(P>0.05)；CTG上调Col-Ⅲ表达(1.08)，有显著性差异(P<0.05)。

2.2Western印迹检测DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达水平 干扰培养各组细胞24 h后，TTG、CTG的DDR2表达水平(1.217、1.239)与CG(1.000)有统计学差异(P<0.05)；TTG、CTG Col-Ⅰ表达(1.428)与CG(1.000)比较有统计学差异(P<0.05)；TTG的Col-Ⅲ表达(0.981)与CG(1.000)比较无统计学意义(P>0.05)；CTG Col-Ⅲ表达(1.319)与CG比较有显著性差异(P<0.05)。见图1。

图1 Western印迹检测DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达

2.3流式细胞仪细胞周期检测结果 干扰培养细胞24 h后，TTG G1/G0期细胞所占比例略高于CG，无显著性差异(P>0.05)；CTG G1/G0期细胞所占比例低于CG，有显著性差异(P<0.05)；TTG与CG S期细胞所占比例无显著性差异(P>0.05)，CTG S期细胞所占比例高于对照组，有显著性差异(P<0.05)；各组G2期细胞所占比例无明显差异(表1)。

表1 各组流式细胞仪细胞周期检测结果

3 讨 论

组织创伤后的修复是极为复杂的问题，成纤维细胞外基质内的胶原是其主要的参与成分，尤其以Col-Ⅰ、Col-Ⅲ为主。组织创伤修复后有大量瘢痕产生，影响了皮肤的美观，甚至因为瘢痕的收缩、粘连从而影响了器官功能。有研究发现，胚胎皮肤创伤修复“无瘢痕愈合”〔9〕。研究表明，创伤无瘢痕愈合的主要机制之一是Col-Ⅲ在细胞外基质中含量增高和(或)与Col-Ⅰ的比例增高〔4～6〕。

TGF-β是一类分泌型多肽细胞因子，可以调节成纤维细胞合成及分泌功能，协调创伤愈合，加速细胞外基质的合成及沉淀。因此，有学者认为TGF-β1参与胶原的产生、促进创伤愈合，甚至是导致瘢痕产生的主要机制〔10〕。DDR可以和胶原蛋白结合，参与炎症、创伤修复等过程。研究表明，DDR2可以被胶原激活，再作用于MMPs，进一步降解胶原。因此，Col-DDRs-MMPs之间的相互作用存在一个正反馈环路，参与组织创伤修复，胶原降解、胶原排列及细胞外基质重构〔11～14〕。TGF-β1可以明显通过促进Col-Ⅰ的分泌而促进组织创伤愈合，但大黄酚却对Col-Ⅰ的合成及分泌功能有抑制作用。

从TGF-β1和大黄酚对DDR2表达的影响结果来看，二者下调了DDR2的合成与表达。TGF-β1促进Col-Ⅰ的合成与分泌可能是参与组织创伤修复的作用机制，即增加细胞外基质的产生而达到促进修复的作用。TGF-β1导致Col-I分泌的增多则可能上调了DDR2表达，再进一步降解Col-Ⅰ。大黄酚的作用则可能是直接上调DDR2表达，进一步降解Col-Ⅰ，同时促进Col-Ⅲ合成，从而增高Col-Ⅲ/Col-Ⅰ的比例，则有可能降低瘢痕产生的可能性。

本实验结果说明成纤维细胞的分裂增殖活性增加。大黄酚促使成纤维细胞的增殖活性增加则说明细胞的数量增加较快，有利于产生较多的细胞外基质，有利于组织创伤的修复〔13～15〕。结合上述大黄酚对Col-Ⅲ、Col-Ⅰ表达的调控作用，大黄酚虽然抑制成纤维细胞Col-Ⅰ的表达，但是可以增加成纤维细胞的增殖活性，从而促进组织创伤的修复。同时大黄酚促进Col-Ⅲ的表达，则可能通过该机制促进创伤修复的同时，减少瘢痕的形成。