整合素β1与Kindlin-2在胃癌及癌前病变组织中的表达及相关性分析*

（丽水市人民医院 消化内科，浙江 丽水 323000）

胃癌的发生是一个涉及多阶段、多因素、多通路的渐变过程，其中整合素在细胞异常增殖、胞外基质降解，新生血管生成等过程中发挥着关键作用[1]。有研究显示，整合素β1 在正常状态下多处于低亲和力状态，但是在多种肿瘤组织中表达量升高[2]。也有体外研究证实，整合素β1 可调节胃癌细胞间的黏附作用，参与胃癌的侵袭、转移过程[3]。但是目前关于整合素β1 在胃癌发生中的激活机制尚不明确。Kindlin-2 蛋白属于一类进化上高度保守的整合素活化蛋白，可特异性结合整合素β1 受体，破坏α、β亚基间的盐键，促进整合素激活，影响细胞外基质的黏附作用，进而导致细胞增殖失控[4]。其癌变的发生机制一直是肿瘤领域的研究重点，对临床早期筛查和个体化治疗具有重要的实践意义。本研究选取慢性胃炎、胃癌癌前病变及胃癌患者作为受试对象，调查Kindlin-2 和整合素β1 在胃癌发生过程中的动态变化，从而为寻找用于早期胃癌诊断以及临床进展监测的相关循环生物标志物提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月—2019年1月在丽水市人民医院消化内科、肿瘤科就诊的80 例胃癌、80 例癌前病变及50 例慢性非萎缩性胃炎患者分别作为胃癌组、癌前病变组和胃炎组。胃癌组男性42 例，女性38例；年龄24～75 岁，中位年龄56 岁，平均（59.84±13.50）岁。癌前病变组男性55 例，女性25 例；年龄18～82 岁，中位年龄55 岁，平均（57.46±13.78）岁。胃炎组男性31 例，女性19 例，年龄18～72 岁，中位年龄54 岁，平均（55.44±12.63）岁。癌前病变组经病理诊断，35 例患者为慢性萎缩性胃炎伴肠型化生，24 例患者为慢性萎缩性胃炎伴轻度异型增生，15 例患者为慢性萎缩性胃炎伴中度异型增生，6 例患者为慢性萎缩性胃炎伴重度异型增生。纳入标准：①经影像学、内镜病理学检查确诊为胃癌、癌前病变或者慢性非萎缩性胃炎；②胃癌前病变患者为慢性萎缩性胃炎伴有肠上皮化生、异型增生；③既往未接受过任何抗癌治疗；④签署知情同意书。排除标准：①有胃癌家族遗传病史；②有严重心脏病病史或肝、肾功能不全；③合并其他恶性肿瘤。本研究通过医院伦理委员会批准。3 组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 主要试剂和仪器

兔抗人整合素β1 单克隆抗体（ab52971，美国Abcam 公司），鼠抗人Kindlin-2 单克隆抗体（MAB2617，美国Millipore 公司）。免疫组织化学试剂盒（PV-9000，北京中山金桥生物科技有限公司），DAB 辣根过氧化物酶显色试剂（P0202，上海碧云天生物科技有限公司）。全自动型石蜡切片机（德国SLEE 公司），BX60 光学倒置显微镜（日本奥林巴斯公司），TK-C1381 图像采集系统（日本JVC 公司）。

1.3 免疫组织化学染色法

取石蜡块连续切片，烘烤后常规滴加二甲苯脱蜡，并用梯度酒精溶液浸泡；滴加柠檬酸枸橼酸钠缓冲液进行组织抗原修复，自然冷却至室温，滴加3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶的活性。滴加整合素β1 单克隆抗体或Kindlin-2 单克隆抗体，以PBS缓冲液作为阴性对照，4℃孵育过夜。滴加二抗，DAB染色5～7 min，用自来水冲洗后终止染色反应，苏木精复染，加入盐酸水溶液分化，水洗后梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.4 结果判断

由丽水市人民医院病理科2 位主治医生进行双盲法阅片。整合素β1 着色部位主要是细胞膜和/或细胞质，Kindlin-2 着色部位主要是细胞质。根据染色强度，从无、淡黄色、棕黄色及深褐色分别记为0、1、2 和3 分。另外根据阳性细胞百分比，从0%、≤10%、＞10%～50%、＞50%～75%及＞75%染色细胞分别记为0、1、2、3 和4 分。染色指数=染色强度×阳性细胞数，若染色指数≥2 则视为阳性表达，否则为阴性表达。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验或χ2趋势检验，进一步的两两比较用χ2分割法；两变量相关分析用Spearman 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组临床资料比较

3 组年龄、性别及不同发病部位等临床资料比较，经方差分析或χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 3 组临床资料比较

2.2 3 组整合素β1 和Kindlin-2 蛋白表达比较

3 组整合素β1 和Kindlin-2 蛋白阳性表达比较，经χ2趋势检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。3 组整合素β1 和Kindlin-2 蛋白阳性表达率逐渐升高，经χ2分割法检验，癌前病变组与胃癌组整合素β1和Kindlin-2 蛋白阳性表达率高于胃炎组（χ2=6.598和34.667，P=0.010 和0.000），且胃癌组整合素β1和Kindlin-2 蛋白阳性表达率亦高于癌前病变组（χ2=18.576，P=0.000）。见表2和图1。

表2 3 组整合素β1 和Kindlin-2 蛋白阳性表达率比较例（%）

图1 3 组整合素β1 和Kindlin-2 蛋白表达情况 （免疫组织化学染色）

2.3 3 组整合素β1 与Kindlin-2 蛋白表达的相关性分析

经Spearman 秩相关性检验，胃炎组与癌前病变组整合素β1 与Kindlin-2 蛋白表达无相关性（P＞0.05）；而胃癌组整合素β1 与Kindlin-2 蛋白的表达呈正相关（P＜0.05）。见表3。

2.4 癌前病变组Kindlin-2 蛋白和整合素β1 表达与临床病理因素的关系

癌前病变组不同年龄、性别、发病部位及病理类型患者的整合素β1 和Kindlin-2 蛋白阳性表达情况比较，经χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

2.5 胃癌组Kindlin-2 蛋白和整合素β1 表达与临床病理因素的关系

胃癌组不同浸润深度、临床病理分期、肿瘤直径及淋巴结转移患者的整合素β1 阳性表达率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。胃癌组不同肿瘤浸润深度、临床病理分期、肿瘤直径及血管侵袭患者的Kindlin-2 蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表3 3 组整合素β1 与Kindlin-2 蛋白表达的相关性分析 例

表4 癌前病变组临床病理因素与整合素β1 和Kindlin-2 蛋白表达的关系 例（%）

表5 胃癌组临床病理因素与Kindlin-2 蛋白和整合素β1 表达的关系 例（%）

续表5

3 讨论

在我国，早期胃癌的确诊率较低，一方面与胃癌发病隐匿、早期症状不典型有关[5]；另一方面也与我国胃癌筛查普及不理想有关[6]。从发病机制角度出发，筛选、发现新的生物标志物对提高早期胃癌的诊断率和临床个体化治疗具有重要的临床价值。

整合素是细胞表面重要的黏附分子，通过α、β非共价键连接形成异二聚体跨膜糖蛋白，主要介导细胞-细胞间、细胞-胞外基质间的黏附作用，进而影响细胞增殖、分化及迁移等生物学过程。不同肿瘤细胞表面整合素受体类型也存在一定的差异[7]，例如在胃癌组织中，整合素α3β1 表达明显增加[8]。由于整合素受体亚型众多，因此本实验选取整合素β1 作为研究重点。在正常生理状态下，整合素β1 需要在活化蛋白的辅助下激活后与胞外基质配体结合形成黏附结构，进一步募集α-Catenin、Talin 等黏附分子并连接细胞骨架，可介导双向信号通路激活，以维持细胞增殖-凋亡平衡。DONG 等[9]学者证实，整合素α3 β1 通过介导ERK1/2 信号通路激活，从而维持肿瘤干细胞表型，促进胃癌的发生。整合素属于T、B 淋巴细胞表面表达的胃肠道炎症关键介质，可促使免疫细胞被选择性招募到炎症部位，参与胃肠道黏膜的炎症反应。张青松等[10]学者通过在Mass ARRAY 平台上筛选，发现整合素存在6 个基因多态性位点，其中ITGA1rs2447867 与非贲门癌的发生风险密切相关。在我国，消化道溃疡、慢性胃炎都属于非贲门癌的重要危险因素，因此整合素介导的炎症反应在非贲门癌的发生过程中发挥着重要作用。既往多数研究只是证实，整合素在胃癌早期转移以及化疗耐药中发挥着重要作用[11-13]，但在本研究中通过免疫组织化学检测，发现整合素β1 在胃癌组织中的阳性表达率明显高于胃炎和癌前病变组织，推断整合素也可能与胃癌癌变的发生有一定的关系。

另外，Kindlin 黏着斑白蛋白属于整合素活化蛋白，通过与整合素β 亚基胞内尾段结合增加整合素与胞外基质的亲和力，进而激活下游一系列信号通路和转录因子等，参与细胞癌变的发生[14]。ZHAO 等[15]发现，上调Kindlin-2 蛋白表达后，可促使乳腺癌细胞进入G2/M 期，从而增加其增殖活性；而且在乳腺浸润性微乳头状癌（invasive micropapillary carcinoma,IMPC）组织中Kindlin-2 表达量与整合素β1 具有一定的正相关性，两者均与IMPC 极性倒转、集团性侵袭和高淋巴结转移密切相关[16]。本研究中也发现整合素β1 和Kindlin-2 在癌前病变和胃癌组织中的表达显著高于胃炎组织，说明在胃癌早期就可以检测到两者表达异常，并且随着胃癌恶性化程度的加重，Kindlin-2 蛋白和整合素β1 的表达都随之增加。但是笔者分析上述两者与癌前病变患者临床病理因素的关系时，并未发现明显的相关性；而且在胃炎患者和胃癌癌前病变患者中，Kindlin-2 蛋白阳性表达和整合素β1 的阳性表达并未表现出正相关性。但是在胃癌患者中，两者阳性表达呈显著的正相关：一方面可能是由于纳入的样本量偏少；另一方面推测Kindlin-2蛋白和整合素β1 是参与胃癌癌前病变向胃癌进展的重要分子，两者在胃癌的发生过程中发挥协同作用，在进入胃癌发展阶段后，Kindlin-2 可激活整合素β1，并增加整合素β1 对细胞外基质、可溶性蛋白等配体的亲和力，进而影响细胞的增殖、侵袭和转移等。

综上所述，整合素β1 和Kindlin-2 蛋白在胃炎、癌前病变和胃癌组织中的表达逐渐升高，推测可能与胃癌的发生存在一定的相关性。而且随着胃癌患者恶性化程度的加重，整合素β1 和Kindlin-2 蛋白阳性表达率也逐渐升高，与肿瘤浸润深度、临床病理分期及肿瘤直径等临床病理因素有关。近年来分子靶向治疗是胃癌研究的热点，本研究证实整合素β1 和Kindlin-2 蛋白有望成为胃癌早期诊断和个体化治疗的潜在靶点，并且为肺癌发病机制的研究、靶向药物的研发提供了新的思路。