金属螺钉与聚氨酯橡胶慢性脊髓损伤大鼠模型的分析比较

杨世昌,杨理,张亮，李文辉，杨亚林，孙伟粽，王云国，王凯

（天津医科大学第二医院骨科,天津300211）

慢性脊髓损伤（chronic spinal cord injury,CSCI）是一种持续存在的脊髓压迫损伤，临床表现为不同程度的神经功能障碍。它是导致患者截瘫和四肢瘫的主要原因之一，随着世界人口老龄化问题愈发凸显，CSCI发病人数逐年增多，给患者及其家庭和社会带来了沉重的负担[1-3]。由于CSCI标本难以从临床获得，因此无法在临床中展开大样本CSCI的病理生理学研究。鉴于此，建立能够模拟人类CSCI的动物模型对于从整体水平、组织水平及细胞分子水平研究人类CSCI的病理生理过程、损伤机制以及有效治疗方法显得尤为重要和紧迫[4-6]。本研究分别从螺钉拧入法和植入物法中选择了研究历史悠久的金属螺钉压迫和新近备受关注的聚氨酯橡胶压迫制作CSCI大鼠模型，通过比较二者的CSCI大鼠模型的优劣，探索适合CSCI研究的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 选取中国医学科学生物工程研究所购入的体重250~300 g的健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠108只（动物批号：DWL1-20170626），依次编号，完全随机分为假手术组（n=36）、金属螺钉压迫组（n=36）和聚氨酯橡胶压迫组（n=36）。大鼠饲养在饮食自由、光/暗周期为12 h/12 h、背景噪音（30~50）db、室温 17~23℃、湿度 30%~70%条件下，并提供大鼠专用食料，保持清洁饮用水充足供应。

图1 抽屉尾翼挂钩型压迫装置Fig 1 Drawer-Hook type compression device

图2 实验所用标准为1.2mm×1.2mm×2.0mm的高分子聚氨酯化合物Fig 2 The standard used in the experiment is 1.2 mm×1.2 mm×2.0 mm high polymer polyurethane compound

图3 高分子聚氨酯化合物化学结构式Fig 3 Chemical structural formula of polymer polyurethane compound

1.2 压迫材料 根据大鼠C5椎管长、宽、直径测量结果：金属螺钉组采用不锈钢材质的抽屉尾翼挂钩型压迫装置，螺丝直径2.5 mm，螺距0.5 mm，螺纹区域长20 mm（图1）；聚氨酯橡胶压迫组使用体积为1.2 mm×1.2 mm×2.0 mm，吸水后逐渐膨胀，于14 d可实现最大膨胀倍数2.5倍的高分子聚氨酯化合物（图2、3）。

1.3 CSCI模型制作 根据国家脊髓损伤统计中心的数据库，中颈段脊髓损伤（C3~C5）的患病率高于上颈段（C1~C2）和下颈段（C6~C8）脊髓损伤[7]。此外，因为大鼠C5水平易于定位，国内外相关研究通常采用C5水平脊髓损伤模型[7-11]。因此，本研究兼顾临床意义与国内外研究特点选择C5水平进行研究。

术前记录3组大鼠的下肢行为学运动功能评分（BBB 评分）[12]，按[0.3×（体重/100 g）+0.1]mL 抽取10%水合氯醛腹腔内注射麻醉。将麻醉满意的大鼠于俯卧位保持躯干伸展固定在操作台上。备皮消毒后，无菌孔巾覆盖手术区，体表定位T2椎体棘突，沿大鼠脊柱正中自T2棘突向头端做一长约3 cm纵行切口，依次切开C5~T2节段背部皮肤、皮下组织及颈背部筋膜，钝性剥离椎旁肌肉，充分暴露C5~T2节段棘突及椎板。（1）假手术组：切除C6椎板后逐层关闭伤口，术后1周切口愈合列入假手术组。（2）金属螺钉组：切除C6椎板后安放抽屉尾翼挂钩型压迫装置，旋入锁定螺钉使钉头与椎板平齐，确认无急性脊髓损伤后，逐层关闭伤口，术后按照0.25 mm半圈/7 d速度拧入至颈椎X线片显示椎管侵占率达50%（约1.00 mm），结束螺钉拧入后继续饲养1周切口愈合，该组模型制作完成。（3）聚氨酯橡胶组：切除C6椎板后将1.2 mm×1.2 mm×2.0 mm标准制备的聚氨酯压块塞入C5椎板与硬膜之间，逐层关闭伤口，术后1周切口愈合，该组模型制作完成。术后2.5 h复苏后行BBB评分，若大鼠BBB评分较术前减少3分以上考虑急性脊髓损伤，处死并补齐相应组，术后单笼饲养，饲养条件同前，所有实验大鼠术后连续5 d腹腔内注射3万单位庆大霉素预防伤口感染，记录术后并发症。

1.4 BBB评分 记录造模术前及术后2.5 h、7 d、14 d、21 d、28 d各组的BBB评分，由熟练掌握BBB评分并经过专业训练的2名实验人员分别观察并记录后取平均值。

1.5 SEP信号测定 各组大鼠模型完成后的7、14、21、28 d（n=4）检测 SEP 信号，麻醉同前，连接好电极，恒流刺激器持续发出频率为5.1 Hz、周期为0.2 ms的方波持续刺激大鼠前肢正中神经，刺激强度逐渐增大至大鼠运动阈值的2倍时，可见前肢肌肉轻度抽搐，通过信号放大器（SCXI-1120，National Instruments Co.，TX，USA）将采集到的信号放大10万倍并应用频率介于2～2 000 Hz之间的带通滤波屏蔽其他波的干扰，并记录2～2 000 Hz之间的波形，通过数据采集卡（DAQcard-1200,National Instrument sCo.,TX,USA）收集所有SEP信号，所收集信号均为12位分辨率和5 000 Hz的采样率，为提高信号准确性，每组实验将500个SEP信号叠加后获得最终结果。后期处理体感诱发电位波形，计算潜伏期延迟及P波与N波之间的波峰差值。

1.6 病理学观察 麻醉同前，仰卧位，打开胸腔，暴露心脏，心脏快速灌注200～250 mL PBS溶液，待右心耳流出无色清亮液后，继续200～300 mL 4%多聚甲醛灌注，直至大鼠躯体及四肢伸直僵硬，表示标本固定完毕。灌注完毕后取C5脊髓节段，置于10%中性福尔马林液中固定，脱水后，石蜡包埋，4 μm切片。分别行HE和TUNEL染色。

1.7 统计学处理 本实验中所有符合正态分布的计量资料均以x±s表示，多个样本均数的比较采用重复测量资料的方差分析进行统计学处理，多个样本均数间的两两比较行两样本均数的t检验，所有数据均由SPSS22.0统计软件分析处理，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 假手术组耗时1周，无急性脊髓损伤例数，术后均成活；金属螺钉组耗时4周，术后出现急性脊髓损伤3例，因伤口感染死亡1例，造模成功率88.89%；聚氨酯橡胶组耗时4周，术后出现急性脊髓损伤2例，无死亡例数，造模成功率94.44%。

2.2 BBB评分 造模术后各组大鼠BBB评分随时间变化见图4。术后假手术组各时间点评分差异无统计学意义（P＞0.05），同时间金属螺钉组与聚氨酯橡胶组较假手术组评分显著降低（金属螺钉组比假手术组t=9.671，P＜0.000 1；聚氨酯橡胶组比假手术组t=4.997，P=0.002 5），且金属螺钉组评分低于聚氨酯橡胶组（t=2.705，P=0.035 3），金属螺钉组评分随术后时间的推移持续降低，聚氨酯橡胶组在术后21 d降到最低后开始上升。

图4 造模术后各组大鼠BBB评分与时间的关系Fig 4 The relationship between BBB scores and time in each group after modeling

2.3 体感诱发电位（SEP） 造模术后各组大鼠SEP检测的潜伏期（图5）和波幅（图6）随时间变化的结果表明，与假手术组各时间相比，金属螺钉组和聚氨酯橡胶组的潜伏期明显延长（金属螺钉组比假手术组t=18.02，P＜0.000 1；聚氨酯橡胶组比假手术组t=10.82，P＜0.000 1），波幅显著降低（金属螺钉组比假手术组t=145.5，P＜0.000 1；聚氨酯橡胶组比假手术组t=3.97，P=0.007 4），且金属螺钉组潜伏期延长时间长于聚氨酯橡胶组，金属螺钉组波幅降低幅度先大于聚氨酯橡胶组，后较之略低。

图5 造模术后各组大鼠SEP潜伏期与时间的关系Fig 5 The relationship between SEP incubation period and time of rats in each group after modeling

图6 造模术后各组大鼠SEP波幅随时间变化的关系Fig 6 Changes of SEP amplitude with time in rats of each group after modeling operation

2.4 HE染色 造模术后各组大鼠脊髓组织HE染色情况见图7。与假手术组相比，金属螺钉组与聚氨酯橡胶组均可观察到脊髓灰质水肿，神经细胞数目减少伴空泡样改变，胶质细胞大量增生并包绕神经细胞，形成瘢痕。金属螺钉组的上述病理学改变随着术后时间递增由脊髓的腹侧向背侧（压迫侧）渐进性加重，聚氨酯橡胶组同时间点损伤表现为一致性。

图7 造模术后各组大鼠脊髓组织HE染色（200×）Fig 7 HE staining of rat spinal cord tissue after modeling（200×）

2.5 TUNEL结果 造模术后各组大鼠TUNEL阳性细胞数目随时间变化关系见图8。金属螺钉组与聚氨酯橡胶组较假手术组TUNEL阳性细胞数目明显增多（金属螺钉组比假手术组t=4.722，P=0.003 2；聚氨酯橡胶组比假手术组t=8.263，P=0.000 2），且主要集中于脊髓灰质前角。金属螺钉组在术后第7天TUNEL阳性细胞达到最高，之后明显减少，聚氨酯橡胶组在术后逐渐增加至术后21 d达到最高。

图8 造模术后各组大鼠脊髓灰质前角TUNEL阳性细胞数目随时间变化关系Fig 8 The number of TUNEL positive cells in the anterior horn of spinal cord gray matter changed with time after modeling

3 讨论

CSCI发病机制复杂，为了更好的研究CSCI的发病机制、病理生理过程及其治疗方法，模拟人类CSCI的动物模型必不可少[13]。最理想的动物为灵长类动物，因其系统功能、组织结构、生理特性等与人类极为相似，但该类动物属于稀有物种，价格昂贵，不但受国家相关法律法规的保护，而且需要特殊饲养，因此不能满足大量临床研究的要求。狗、羊、牛等动物同样因进化程度、社会、经济等原因并不适用于临床大样本模拟研究。而大鼠因良好的临床相关性、抗感染能力强、同源性好、生长周期短、经济负担小等诸多优点，多用于当前CSCI的大样本实验研究。

理想的CSCI大鼠模型应尽量复制人类CSCI发生及进展的完整过程，即脊髓能够受到一定程度的外力压迫，而且该压迫是持续、渐进性的。因此，构建理想的CSCI大鼠模型应尽量满足以下条件：（1）操作简单，即所用设备要求不高，能快速大批制作，死亡率低，并发症少，同时这种方法具有广泛的适用性，能够不受动物体形、大小等因素的影响。（2）可控制性较好，即脊髓所受压迫的程度、时间等可自由控制，且压迫力能尽量符合线性改变的特点。（3）可移植性好，即在同一实验中能使用相同的方法使脊髓在不同部位受压迫，使得在脊髓某节段造模困难的情况下，可更改压迫部位。（4）临床相似度高，能尽可能完整模拟人类CSCI特性，且在尽量不破坏脊柱生理结构的条件下造成椎管相对狭窄。

对于CSCI大鼠模型的制备，方法各异，主要有撞击损伤模型、横断损伤模型、缺血损伤模型、钳夹损伤模型等[14]。螺钉拧入法由Hukuda等于1972年首次用于犬CSCI模型制作，后因Kanhiku等发现该压迫是一种初期速度偏快、后期速度偏慢的非线性压迫，且会造成脊髓神经纤维传导损害而废弃。1993年，al-Mefty等采用改良材质的特氟隆螺钉造模犬CSCI并被Kanhiku等于新西兰兔复制。Lee、Xu等采用自制金属慢性压迫装置在大鼠造模成功。2004年，Kim等在大鼠的C5~C6椎板间放置聚氨酯橡胶块，逐渐膨胀的橡胶块对脊髓产生了进行性的慢性压迫，成功建立了CSCI大鼠模型，其操作简单，易于模拟脊髓慢性压迫，但不易控制压迫进程。通过上述实例、文献检索以及前期充分验证，笔者分别从螺钉拧入法和植入物法中选择了研究历史悠久的金属螺钉压迫和新近备受关注的聚氨酯橡胶压迫制作CSCI大鼠模型。

本研究成功复制了金属螺钉压迫与聚氨酯橡胶压迫模型，并对二者进行了行为学与病理学方面的研究和对比。金属螺钉组和聚氨酯橡胶组大鼠的BBB评分均较假手术组明显降低，且金属压迫组下肢行为运动功能的恢复情况不佳，其BBB评分持续下降，聚氨酯橡胶组的恢复情况优于金属压迫组。金属螺钉组和聚氨酯橡胶组SEP信号与假手术组相比均出现潜伏期延长和波幅下降，且金属螺钉组神经功能恢复略差。从HE染色上看，两压迫组均出现脊髓损伤的病理性表现，金属螺钉组的脊髓损伤区域从腹侧到背侧（压迫侧）渐进性加重，聚氨酯橡胶组脊髓整体均有压迫，较为符合临床实际病理特征。两压迫组较假手术组TUNEL阳性细胞数目明显增多，且聚氨酯橡胶组与金属螺钉组相比，其凋亡细胞存在时间更长，数目更多，脊髓压迫更为稳定持久。

综上，金属螺钉压迫与聚氨酯橡胶压迫的CSCI大鼠模型均有效地实现了对CSCI的模拟。金属螺钉CSCI模型虽然制模步骤复杂，周期长，但压迫程度可调，因此适合损伤程度逐渐加重的CSCI研究。聚氨酯橡胶CSCI模型虽然压迫程度不可控，但制模过程简便，周期短，成功率高，因而适用于压迫程度稳定的CSCI研究。