碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的临床特征及克隆变迁

孔海芳，胡志东

（天津医科大学总医院医学检验科，天津300052）

鲍曼不动杆菌是院内感染的常见条件致病菌，当患者有严重基础疾病、免疫力低下或接受侵袭性操作时，可引起严重感染，如呼吸机相关性肺炎、菌血症、泌尿道感染、伤口感染以及继发的脑膜炎等[1]。随着广谱抗菌药物的使用，鲍曼不动杆菌对临床常见抗生素的耐药性不断增加，碳青霉烯类药物作为治疗鲍曼不动杆菌感染的最后一道防线，其耐药性也日趋严重，2018年CHINET细菌耐药监测报道，鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为73.2%和73.9%[2]。近年来，碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌（Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）呈现多重耐药、泛耐药甚至全耐药传播，且以克隆传播的方式在医院之间或医院内进行传播，给公共卫生和临床抗感染治疗带来巨大挑战。笔者通过研究天津医科大学总医院CRAB的临床特征、耐药机制以及流行病学情况，旨在为临床CRAB的诊疗和预防提供有力的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集天津医科大学总医院2011年1月—2018年12月无菌体液及下呼吸道标本［肺泡灌洗液和痰］中分离出CRAB 242株，同一患者仅选取首次培养阳性的菌株。临床分离标本有腹腔引流液、全血、分泌物、引流液、PICC导管、胸腔积液、脑脊液、尿液、胆汁、痰、肺泡灌洗液。

1.1.2 仪器和试剂 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（matrix-assistedlaserdesorptionionizationtime of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）和药敏卡AST-GN16（法国生物梅里埃公司），9700型PCR仪（美国Perkin Elmer公司）；限制性内切酶XbaI和ApaI（大连宝生物制品有限公司），Easy Taq酶、10×Buffer、dNTP、DNA Mark（北京全式金生物技术有限公司）。Tris、硼酸、EDTA、溴化乙锭（EB）、十二烷基肌氨酸钠、低溶点胶、蛋白酶K、引物（上海生工生物工程股份有限公司）；去氧胆酸、Brij 58（美国Sigma公司）；PFGE琼脂糖（美国 Bio-Rad公司）；琼脂糖（上海Invitrogen生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定及药敏试验 采用MALDI-TOF MS对菌株进行鉴定，AST-GNl6药敏卡做药敏，纸片扩散法检测头孢哌酮/舒巴坦，折点参考头孢哌酮，结果判读参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）2019年标准[3],替加环素参照美国食品药品监督局(FDA)判定折点[4]。以大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853作为药敏的质控菌株，所有操作严格按照操作规程进行。

1.2.2 碳青霉烯酶基因检测 采用多重PCR检测D类OXA型碳青霉烯酶（OXA-51-like、OXA-23-like、OXA-58-like、OXA-24-like），引物合成及扩增条件参照文献[5]；采用单一PCR检测B类金属β-内酰胺酶（VIM、NDM、IMP、SIM），引物合成及扩增条件参照文献[6]。

1.2.4 脉冲场凝胶电泳（PFGE） 参照文献[7-8]提出的鲍曼不动杆菌PFGE方案进行试验，以Salmonella enterica serotype Braenderup strain H9812作为PFGE标准分子量。PFGE图谱判读参照Tenovel等[9]提出的标准：PFGE条带相差≥7条为流行病学的不同克隆。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件，计量资料用x±s或中位数（M）表示，采用t检验或秩和检验。计数资料用例（百分数）表示，采用χ2检验，P＜0.05有统计学意义。Whonet5.6软件统计分析药敏结果。

2 结果

2.1 CRAB感染的基本情况 242株CRAB主要来源于下呼吸道标本，其次为尿液和血液；47.9%的患者来源于ICU。感染CRAB患者男性151例，女性91例，平均年龄（60.7±19.1）岁。分离菌株前患者住院时间平均为18 d，患者入院时APACHⅡ评分为（21.60±9.90）分，分离菌株前3个月内使用碳青霉烯类抗生素患者占53.3%（129/242）,使用三代头孢菌素占44.2%（107/242），1个月内进行手术患者占58.3%（141/242），进行机械通气患者占81.0%（196/242），中央静脉插管患者占52.9%（128/242）,感染CRAB患者的死亡率为26.4%（64/242）。

2.2 CRAB药敏试验结果和碳青霉烯酶基因检测 所有菌株均为多重耐药菌。CRAB对不同抗生素的耐药性如下：阿米卡星为21.2%，庆大霉素为74.9%，环丙沙星为92.1%，左氧氟沙星为54.1%，头孢哌酮/舒巴坦为18.4%，替加环素为5.5%，亚胺培南均耐药，未发现对多黏菌素耐药的菌株。

242株CRAB均有blaOXA-51基因,证实为鲍曼不动杆菌，97.5%的菌株携带blaOXA-23基因，所有菌株未检测出blaOXA-24-like、blaOXA-58-like、blaIMP、blaVIM、blaSIM、blaNDM基因。

2.3 CRAB克隆变迁 经PFGE分型表明2011—2015年CRAB的克隆型发生明显变迁，2016—2018年CRAB菌株85%以上均为A克隆型，现将2011-2015年79株CRAB进行分型。79株CRAB分为15种（A～O）PFGE克隆型（图 1），其中 A 和 C 是主要流行克隆型，A型占46.8%（37/79）、C型占25.3%（20/79）。5年内克隆变迁情况见图2。2011—2013年CRAB总例数逐年增加，2014年有所下降后，2015年又迅速上升。2011年CRAB菌株呈现散发；2012年以 C型为主占77.8%（7/9）；2013年以A型和C型为主，A型占35.3%（6/17），C型占29.4%（5/17）；2014年以A 型为主占 83.3%（10/12）；2015年以A型为主占61.8%（21/34）。C型一直贯穿2011—2015年，2012年成为主要的克隆型，2013年A型开始出现，并取代C型成为2013—2015年主要克隆型，且分离菌株数逐年增加，B型主要出现在2013年，2015年仅分离到1株。A克隆型对亚胺培南高度耐药（MIC50=64 μg/mL、MIC90=128 μg/mL），对美罗培南中度耐药（MIC50=16 μg/mL、MIC90=64 μg/mL），且与碳青霉烯类抗生素（χ2=5.80，P=0.016）和中央静脉插管有关（χ2=5.80，P=0.016）；C 克隆型对亚胺培南中度耐药（MIC50=16 μg/mL、MIC90=64 μg/mL），对美罗培南低度耐药（MIC50=8 μg/mL、MIC90=32 μg/mL），且与三代头孢菌素的使用相关（χ2=4.65，P=0.031），A克隆型及C克隆型患者的死亡率分别为12.7%（10/79）及 5.06%（4/79），差异无统计学意义（χ2=0.346，P＞0.05），见表 1。

图1 79株CRAB感染菌株PFGE聚类分析树状图Fig 1 Dendrogram of 79 A.baumannii nosocomial isolates analyzed by PFGE

图2 2011—2015年CRAB菌株克隆变迁情况Fig 2 Annul distribution of the isolates,major endemic pulsotypes,and trend line of CRAB from 2011 to 2015

表1 2011—2015年CRAB菌株主要流行菌株的临床特征Tab 1 Characteristics of predominant clones of Acinetobacter baumannii from 2011 to 2015

3 讨论

CRAB的出现和流行，给临床抗感染治疗带来极大困难，现已成为严重的公共卫生问题，由于CRAB具有快速获得和传播耐药性的能力，多重耐药、泛耐药甚至全耐药菌株在世界范围内流行[10]。CRAB在ICU、神经外科病房极易流行，且病死率高，目前仍没有特效抗生素治疗，因此合理的流行病学监测和干预成为亟待解决的实际问题。报道称使用碳青霉烯类抗生素、入住ICU、机械通气、气管插管等是CRAB感染的独立危险因素[11-13]。本研究47.9%的患者入住ICU，53.3%的患者3个月内使用过碳青霉烯类抗生素，58.3%的患者1个月内进行过手术，81.0%的患者进行过机械通气，52.9%的患者接受过中央静脉插管，患者死亡率为26.4%，高于之前报道[14]，可能的原因是患者入住ICU，多合并严重的基础疾病，接受中央静脉插管、留置导尿管、机械通气，广泛使用抗生素等加速患者的死亡。

碳青霉烯酶是CRAB的主要耐药机制，主要包括B类金属酶和D类苯唑西林酶，以D类酶最常见。OXA-51是鲍曼不动杆菌天然染色体介导的OXA酶，正常情况下不表现水解碳青霉烯类抗生素的活性，其他OXA酶均为外源性获得，具有水解碳青霉烯类抗生素的活性,其中OXA-23在世界各大洲都有发现，是临床分离CRAB最主要的碳青霉烯酶[15-17]。本研究97.5%的CRAB均携带blaOXA-23基因，OXA-23是医院CRAB最主要的碳青霉烯酶。吴海燕等[18]发现产OXA-23型碳青霉烯酶的CRAB是山东省泰安市某院流行的主要克隆型。张吉生等[19]同样发现中国佳木斯某医院OXA-23型碳青霉烯酶是CRAB主要的耐药机制。Liu等[20]发现质粒pAZJ221和转座子Tn2009与鲍曼不动杆菌blaOXA-23基因广泛流行相关，这也是鲍曼不动杆菌blaOXA-23基因在各地区水平传播的主要原因。

为了更好的了解院内感染鲍曼不动杆菌流行病学和传播能力，许多分子分型技术得以引入，PFGE分型方法重复性好、分辨率高、结果稳定，是细菌分子生物学分型技术的“金标准”[21]。本研究共分离出15种克隆型，以A和C克隆型为主，2012年以携带blaOXA-23基因的C克隆型为主，这一克隆型对亚胺培南中度耐药（MIC50=16 μg/mL），对美罗培南低度耐药（MIC50=8 μg/mL），且这一克隆型与三代头孢菌株的使用有关；2013年携带blaOXA-23基因的A克隆型出现后成为主要的流行菌株，A克隆型对亚胺培南高度耐药（MIC50=64 μg/mL），对美罗培南中度耐药（MIC50=16 μg/mL），这一克隆型与碳青霉烯类抗生素的使用、中央静脉插管相关。在本研究中，碳青霉烯类抗生素的使用不断增加，头孢菌素类抗生素的使用有所下降，这可能也是导致C克隆型向A克隆型转变的一个原因，同时说明广谱抗生素使用的选择压力，不但没有完全杀死鲍曼不动杆菌，反而使鲍曼不动杆菌持续存在且不断进化[22]。吴伟元等[23]研究深圳市8年CRAB的感染特征和克隆变迁情况，发现深圳市以携带blaOXA-23-like基因的高耐药CRAB为主，并且D克隆型逐渐取代A克隆型和C克隆型成为主要的克隆株型。

从菌株的时间和空间分布上分析，ICU是CRAB的主要分布区，ICU患者往往合并多种基础疾病，常有侵入性操作，广泛使用抗生素等危险因素，易感染耐药菌株，也是各大医院分离CRAB较多的科室。A和C克隆型在各个科室都存在，说明CRAB已经在各个科室传播，科室间存在交叉感染的可能性，这种传播可能是导致医院CRAB不断增加的原因之一，耐药克隆菌株的传播往往借助人工呼吸机等设施和医护人员的手进行传播，因此医护人员要勤洗手，严格遵守无菌操作和消毒规范，发现感染患者要及时隔离等。

目前在临床治疗过程中，鲍曼不动杆菌因其较高的耐药性，导致感染患者较高的致死率。因此在缺乏有效的、新的抗菌药物的情况下，临床医生应合理使用目前现有的抗生素治疗鲍曼不动杆菌的感染。中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识中指出，多重耐药鲍曼不动杆菌的治疗建议使用两药联合甚至三药联合治疗，主要包括以舒巴坦为基础的联合、以替加环素为基础的联合和以多黏菌素为基础的联合[24]。本研究发现，医院鲍曼不动杆菌对头孢哌酮舒巴坦、替加环素以及多黏菌素的耐药性均较低，因此建议医院医生根据疾病程度和药敏结果合理选择抗生素，联合治疗，争取达到疗效最大、毒性最小的治疗效果，这将对于减少耐药菌株的产生和控制CRAB的感染具有重要的意义。

综上所述，携带blaOXA-23基因的CRAB高耐药A克隆型菌株在医院已经流行，应切实采取积极有效的措施，并对CRAB菌株进行持续流行病学研究，以预防和控制CRAB的进一步传播。