东方百合转化探究

冯慧敏 张 伟 洪 波

（大兴安岭职业学院 黑龙江大兴安岭 165099）

百合花姿优美，色彩丰富，位列四大鲜切花，深受人们的喜爱。百合花粉颜色较深，附着性强，一般使用前需要人工摘除，以防止污染花瓣和衣物等。如何解决花粉污染问题一直是百合育种的研究热点之一。文章应用转基因技术，对东方百合进行转化改造，将外源基因ZM401 导入东方百合基因组，促使花药特异性表达，花药不能正常发育形成，也就不能形成花粉，从而解决花粉污染问题，为培育百合无花粉新品种进行探索研究。

1 实验材料

应用东方百合的组培苗生长的小鳞茎鳞片为植物实验材料。目标基因借助根癌农杆菌菌株LBA4404 进行转化，菌株含携带ZOM401 基因的质粒pBI121，目标片断大小为702 个bp。

2 实验方法

2.1 建立东方百合鳞片外植体的高频再生体系

取组培苗直径约1.5 cm 小鳞茎的鳞片，切成四周都有伤口约0.5 cm2的小块，注意切掉鳞片基部可能存在潜伏芽的部位，将处理好的外植体接种在含生长素0.2 mg/L NAA的基础培养基（单位符号为mg/L，以下无特殊说明均省略），细胞分裂素BA 设5 个浓度梯度，依次为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5。每种浓度处理接种30 个外植体，30 d 继代一次。45 d 后统计鳞片分化情况。

再生苗生长至2～3 cm 高时转入1/2MS 生根培养基，设2 个NAA 浓度梯度，分别为NAA0.2 和NAA0.5。生根培养45 d 统计生根结果。苗高5～6 cm、根长3～5 cm 时进行移栽驯化，最后栽植到蛭石∶草炭土=1∶1 的基质中。

2.2 潮霉素选择浓度试验

鳞片高频再生培养基（MS + NAA 0.2 + BA 1.5）中添加潮霉素，浓度梯度为0、10、20、30、40、50，每种浓度接种鳞片40 个，培养一个月后统计结果。

2.3 农杆菌介导的遗传转化

2.3.1 培养基组成

通过再生实验结果分析，确定东方百合鳞片再生培养基为MS + NAA0.2 + BA1.5。选择培养基在此基础上添加Hy40 和Cb300。为了促进鳞片芽的形态建成降低BA浓度，即发育培养基为MS + NAA0.2 + BA0.5 + Hy40 + Cb300。生根培养基为1/2MS + NAA0.5+ Hy40 + Cb300。

2.3.2 转化实验步骤

把东方百合鳞片外植体接入分化培养基诱导3 d 后放入OD600 =0.4～0.6 的菌液中侵染5 min，取出后用无菌滤纸吸干菌液，接种在预培养基中，暗培养2～4 d，温度控制在26 左右。然后将鳞片外植体转入选择培养基培养，30 d 继代转接一次，培养60 d 后转入发育培养基继续培养。当抗性再生苗高约2 cm 时转入生根培养基。

3 结果与分析

3.1 东方百合鳞片外植体高频再生体系的建立

3.1.1 不同浓度BA 对鳞片不定芽诱导的影响

鳞片接种7 d 左右颜色加深，体积膨大，10 d 后开始出现淡黄色或白色芽点，14 d 后开始分化不定芽。30 d 后除含BA2.0 的培养基外其他各BA 浓度培养基诱导的鳞片外植体都分化出芽，并形成小植株。培养45 d，含BA1.5 的培养基中再生芽长1.2 cm 左右。不同BA 浓度梯度培养基中，再生芽增殖系数分别为2.25、2.41、3.08、2.25、1.58，所有鳞片外植体都可分化出芽，其中含BA1.5培养基中的外植体分化芽数最多，增殖系数最高，可作为鳞片外植体诱导分化培养基。试验结果见表1。

3.1.2 不同浓度NAA 和MS 或1/2MS 组合对东方百合再生苗生根的影响

再生苗高2～3 cm 时转入生根培养基，生根培养基为MS 和1/2MS 培养基中添加NAA（0.2 和0.5），培养8 d 左右再生苗开始生根，根黄绿色，生长健壮，并有大量白色根毛。

生根培养45 d 结果如下：1/2MS+NAA0.5 培养基中的幼苗叶丛基部多数形成小鳞茎，每株叶4～6 片，具长柄，叶披针形，绿色。根黄绿色，根毛长约2 mm，根径约1.5 mm以上根长3～4 cm，平均每株生根11.2 根。该培养基诱导根的质量最高，根较长且粗壮，而且平均每株生根数量11条以上，能够保证正常的营养供应，盆栽成活率和大田移栽成活率都是最高的。

表1 鳞片外植体不定芽诱导分化的情况

3.2 潮霉素对鳞片外植体再生的影响

将百合鳞片外植体接种到含潮霉素的再生培养基中诱导培养7 d 后，鳞片褪绿变白，潮霉素浓度越高白化现象愈严重。接种Hy40 中的鳞片外植体87.5%褐化死亡，可选择Hy40 为亚致死浓度。当Hy 浓度达到50，所有外植体都死亡，为致死浓度。选择鳞片潮霉素抗选择压为40 mg/L，能抑制或杀死非转化细胞，又不抑制转化细胞正常生长。

3.3 鳞片遗传转化的结果

东方百合鳞片外植体侵染培养4 d 后转接到选择培养基中继续诱导，生长13 d 后多数外植体切口出现褐化的现象，培养时间越长，外植体褐化死亡越多，仅有少数的外植体膨胀变大。培养30 d 后有3～7 个的外植体（接种100个/重复）出现淡黄色芽点，大部分外植体死亡或失去再生能力。培养50 d 获得2～4 抗性芽，培养60 d 抗性芽1 cm左右，转入发育培养基。再培养至芽长2 cm 左右，转入生根培养基。18 d 后抗性芽生根，（对照10 d 开始生根），培养45 d 根长1～3 cm（对照2～5 cm），再生芽叶片伸长，植株基部开始形成小鳞茎。

东方百合鳞片外植体遗传转化试验共获得23 个抗性芽，占侵染总数3 000 块的0.76%。

3.4 转基因植株的PCR 检测

对东方百合转化筛选出的23 株苗进行PCR检测，其中9 株显示为阳性，初步确认ZM401 基因整合到东方百合基因组中。东方百合共侵染3000 块鳞片外植体，获得阳性转基因株系9 个，遗传转化率0.3%。

4 讨论

百合鳞片培养可直接形成不定芽和愈伤组织，是良好的遗传转化材料[4]。用组培无菌苗作转化受体材料，取材不受季节的限制，还能避免消毒剂的影响，较适合作为受体外植体材料。而且直接分化成苗，变异率小，分化率较高。鳞片外植体再生苗主要分布在鳞片的伤口处，鳞片的底部较多，上部稍少，两侧切口形成的最少，有可能是鳞片内部的激素分布不均造成的。所以外植体材料应尽可能选择鳞片底部部位。而且再生芽多是从切口处诱导形成的，有利于农杆菌侵染，可提高转化率。[5～7]菌液侵染浓度对百合转化效率影响较大，实验过程中菌液稀释20 倍以上时进行侵染实验，侵染几百个鳞片外植体，仅获得1 个抗性芽，经PCR 检测还是假阳性的。虽然侵染菌液浓度低，抗生素应用量少，对外植体影响小，但是极难成功转化，可见菌液浓度不能太低。