miR-499 与miR-1 对心肌细胞增殖与凋亡调控作用及机制研究

李倩晓 于勤 那荣妹 刘百亭

1.浙江省中西医结合医院，浙江 杭州310000；2.大连大学附属中山医院，辽宁 大连116001

心肌细胞凋亡是心律失常、心肌梗死、心力衰竭等多种心脏疾病发生、发展过程中的重要病理环节之一［1]。对心肌细胞凋亡进行积极干预已成为治疗心脏疾病的关键研究方向。微小RNA（microRNA，miRNA）在细胞增殖、分化及凋亡中发挥重要作用，参与心血管疾病、神经系统疾病、肿瘤等病理生理过程［2]。研究显示，miRNA 可调控30%以上人类基因表达［3]。miR-499、miR-1 是与心脏疾病关系密切的两种miRNA，近年来已得到广泛研究，尤其在调控心肌细胞增殖与凋亡方面越来越受到关注，但其具体调控机制目前尚不明确。因此，本研究将miR-499mimics 及miR-1inhibitor转染至H2O2处理的心肌细胞，探索心肌细胞增殖与凋亡过程中，miR-499 与miR-1 所发挥的调控作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 大鼠H9C2 心肌细胞株（中科院上海细胞库）。

1.2 实验试剂与仪器 0.05%胰酶/EDTA、胎牛血清、DMEM 培养基（Hycloneo 公司，美国）；竞争性短核糖核苷酸阴性对照序列（scramble-NC）、miR-1 inhibitor、miR-1、miR-499、U6 引物序列（上海吉凯基因化学技术有限公司，中国）；miR-499 mimics（广州锐博公司，中国）；转染试剂脂质体Lipofectamine2000（Invitrogen公司，美国）；H2O2、膜联蛋白（An-nexin）V-异硫/碘化丙锭（PI）细胞凋亡试剂盒、CCK8 试剂盒（碧云天试剂公司，中国）；二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（Thermo 公司，美国）；β-actin、Bcl-xl、Bax 单抗购自（Epitmics 公司，美国）；ECL 化学发光试剂盒（millipore 公司，美国）；RNasee Free ddH2O、miRNeasy Serum/plasma Kit、miScript SYBR Green PCR Kit、逆转录试剂盒（QIAGEN 公司，德国）；7500 Fast real time PCR 仪（ABI 公司，美国）；酶标仪（Bio Tek 公司，美国）。

1.3 细胞培养 将H9C2 心肌细胞置于培养箱中培养，每3d 进行1 次细胞传代。实验前24h 取对数生长期的细胞备用。

1.4 转染 将细胞分为阴性对照组、miR-499 mimics组、miR-1 inhibitor 组、空白对照组。阴性对照组、miR-499 mimics 组及miR-1 inhibitor 组分别采用随机合成的miRNA 片段、miR-499 mimics 及miR-1 inhibitor 片段通过LipofectamineTM2000 进行转染（浓度200nm），处理时间6h。空白对照组不予任何处理。随后将细胞继续置于培养箱中，培养48h 后收集细胞。

1.5 转染结果检测 采用miRNeasy Serum/plasma Kit试剂盒提取血清RNA，检测RNA 纯度。采用逆转录试剂盒将miRNA 逆转录为特定cDNA，-80℃下保存备用。RT-PCR 反应：以cDNA 作模版，配制阴性对照组、miR-499 mimics 组、miR-1 inhibitor 组、空白对照组反应管，以U6 作内参，依据试剂盒及仪器说明书严格进行操作。

1.6 实验分组分为空白对照组、H2O2组（未转染的H9C2 心肌细胞）、干预组A（miR-499 mimics 转染的H9C2 心肌细胞）、干预组B（miR-1 inhibitor 转染的H9C2 心肌细胞）、干预组C（miR-499 mimics+miR-1 inhibitor 转染的H9C2 心肌细胞）。

1.7 H2O2处理 H2O2组、干预组A、干预组B 及干预组C 均采用200μmol/L 的H2O2处理6h，空白对照组不予任何处理。

1.8 细胞增殖及凋亡检测 将细胞以1×104个/孔接种至96 孔板中，并置于37℃、5%CO2培养箱培养12h以上。细胞贴壁后，将H2O2处理的各组细胞加入96 孔板中，经CCK8 试剂处理后，置于培养箱中培养2h，震荡5min，于570nm 波长处测定OD 值。取H2O2处理后的各组细胞，PBS 洗涤3 次，消化、离心、收集细胞后，PBS 洗涤2 次，再次离心，收集细胞。随后加入binding buffer（200μL），制成单细胞悬液后，分别加入Annexin V-FITC 和PI 试剂（浓度250μg/mL）各5μL，避光反应10min 后，即予流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.9 Bcl-xl、Bax 蛋白表达水平检测 将细胞加入裂解液处理30min，收集蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，蛋白样品煮沸变性5min，上样，每泳道40μg 蛋白样品经80g/L SDS-PAGE 电泳分离蛋白1～2h 后，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2h，分别加入1∶1000 稀释的βcatenin、Bcl-xl、Bax 特异性抗体。4℃孵育过夜后，PBST 液洗膜，加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，室温孵育2h，ECL 显色，Image J 软件分析各条带光密度。

1.10 观察指标 ①RT-PCR 检测miR-499 mimics 及miR-1 inhibitor 转染效果；②各组H9C2 心肌细胞增殖检测结果；③各组H9C2 心肌细胞凋亡检测结果；④各组H9C2 心肌细胞Bcl-xl、Bax 蛋白表达检测。

1.11 统计学分析 采用SPSS 23.0 软件进行统计分析，计量资料采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，P＜0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR 检测miR-499 mimics 及miR-1 inhibitor转染效果 与阴性对照组、空白对照组比较，miR-499 mimics 组H9C2 心肌细胞miR-499 表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与阴性对照组、空白对照组比较，miR-1 inhibitor 组H9C2 心肌细胞miR-1 表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 心肌细胞增殖及凋亡检测结果 H2O2组细胞增殖较空白对照组减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。干预组A、干预组B、干预组C 细胞增殖较H2O2组增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。H2O2组细胞凋亡率较空白对照组增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。干预组A、干预组B、干预组C 细胞凋亡率较H2O2组减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 RT-PCR 检测miR-499 mimics 及miR-1 inhibitor转染效果（±s）

表1 RT-PCR 检测miR-499 mimics 及miR-1 inhibitor转染效果（±s）

注：与阴性对照组、空白对照组比较，*P＜0.05；与空白对照组比较，▲P＞0.05

组别 miR-499 miR-1空白对照组 1.02±0.12 0.66±0.14阴性对照组 1.05±0.15▲ 0.71±0.16▲miR-499 mimics 组 1.97±0.25* -miR-1 inhibitor 组 - 0.23±0.08*

表2 心肌细胞增殖及凋亡检测（±s）

表2 心肌细胞增殖及凋亡检测（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与H2O2 组比较，#P＜0.05

组别 细胞增殖（OD 值） 细胞凋亡率（%）空白对照组 0.43±0.35 2.83±0.45 H2O2 组 0.17±0.18* 24.32±1.36*干预组A 0.30±0.24*# 7.62±1.43*#干预组B 0.26±0.21*# 10.43±1.94*#干预组C 0.38±0.26*# 4.58±0.75*#

2.3 Bcl-xl、Bax 蛋白表达水平 H2O2组Bcl-xl 蛋白表达水平较空白对照组降低，Bax 蛋白表达水平较空白对照组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。干预组A、干预组B、干预组C Bcl-xl 蛋白表达水平较H2O2组升高，Bax 蛋白表达水平较H2O2组降低，存差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 Bcl-xl、Bax 蛋白表达水平（±s）

表3 Bcl-xl、Bax 蛋白表达水平（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与H2O2 组比较，#P＜0.05

组别 Bcl-xl Bax空白对照组 0.973±0.138 0.267±0.051 H2O2 组 0.383±0.042* 0.713±0.045*干预组A 0.787±0.048# 0.553±0.035#干预组B 0.837±0.066# 0.573±0.035#干预组C 0.935±0.085# 0.323±0.026#

3 讨论

在心脏疾病发生发展过程中，miRNA 发挥着重要调节作用［4，5]。miRNA 广泛存在于真核生物中，由18～25 个核苷酸构成，属于非编码型小分子RNA，在物种间高度保守，具有组织特异性、时序性，与心血管疾病关系密切，影响miRNA 表达可引起心律失常、心肌肥厚、心肌梗死等，是生命科学领域中目前重点及热点研究方向［6-9]。

心肌受损的重要形式是心肌细胞凋亡，最终导致心脏收缩功能进行性下降［10]。在心肌细胞凋亡经典通路中，以线粒体凋亡通路尤为重要。Bcl-2 家族蛋白是线粒体凋亡通路的主要调节蛋白，包括抗凋亡蛋白（如Bcl-xl，可抑制细胞凋亡）与促凋亡蛋白（如Bax，可促进细胞凋亡），共同调节细胞凋亡［11，12]。

研究发现，miR-499 在心室中高度表达［13]。miR-499 在心肌细胞氧化应激损伤过程中，具有抑制心肌细胞凋亡作用［14]。与无心力衰竭患者比较，缺血性心力衰竭患者miR-499 表达下调了3.5倍［15]。通过上调急性心肌梗死大鼠心肌组织miR-499 表达，其心肌细胞凋亡率显著降低［16]。在本研究中，经H2O2处理后，心肌细胞凋亡率显著升高，而通过miR-499 mimics 转染的心肌细胞凋亡得到明显抑制，表明上调miR-499对心肌细胞具有保护作用。

miR-1 在调控心肌细胞分化以及心脏功能、心律失常方面具有重要作用，是心肌细胞中含量最高的miRNA［17-19]。过表达miR-1 可使心肌细胞凋亡率增加［20]。在心肌细胞中，miR-1 为响应氧化应激，表达量显著提高，进而促进心肌细胞凋亡，增加心力衰竭发生概率［21]。研究发现，在高糖条件下，其表达量显著提高，进而促进心肌细胞凋亡［22]。本研究将miR-1 inhibitor转染至H9C2 心肌细胞，予H2O2处理，结果显示，miR-1 inhibitor 干预后心肌细胞凋亡率较未转染心肌细胞显著降低，表明miR-1 对心肌细胞凋亡具有促进作用。

本研究表明上调miR-499 或抑制miR-1 均能有效提高心肌细胞增殖。当两者同时进行干预后，心肌细胞增殖可进一步提高，而细胞凋亡率则进一步降低。通过检测重要抗凋亡蛋白Bcl-xl、促凋亡蛋白Bax，发现转染miR-499 mimics 和miR-1 inhibitor 心肌细胞，Bcl-xl 明显升高，而Bax 明显降低，当两者同时进行干预，则其升高及降低幅度尤为显著，表明miR-499 可能是通过上调Bcl-xl、下调Bax 蛋白发挥抑制细胞凋亡作用，而miR-1 则通过下调Bcl-xl、上调Bax 蛋白发挥促进细胞凋亡作用。但是，两者对于Bcl-xl、Bax蛋白的调控是直接调控还是通过调控相关靶基因间接调控尚未清楚，其具体调控机制仍需大量实验加以验证。

综上所述，在心肌细胞增殖与凋亡过程中，miR-499 与miR-1 发挥重要调控作用。miR-499 通过上调Bcl-xl、下调Bax 蛋白表达抑制心肌细胞凋亡，而miR-1 则通过下调Bcl-xl、上调Bax 蛋白表达促进心肌细胞凋亡。随着相关研究的不断深入，将有助于为心血管疾病的预防和治疗探索出新的策略。