基于响应面法优化玉米秸秆酶降解条件研究

康 琴，叶琳洋，徐玉姗，牟 莉

(长春大学 食品科学工程学院，吉林 长春 130022)

植物纤维素资源是世界上最丰富的生物资源之一。将植物纤维素资源转化为优质化工产品的糖是数十年来科学研究的核心，有助于解决化石能源稀缺和全球环境变化的问题[1]。在全球范围内，植物纤维素的利用率很低。我国是一个农业大国，拥有丰富的植物纤维素资源，其中玉米秸秆高居首位。合理利用纤维素酶降解玉米秸秆，既有利于减少玉米秸秆处理不当而造成的环境污染，又能产生巨大的经济效益[2-3]。

目前在实验研究中使用的植物纤维素降解方法主要有三大类：物理法(微波、超声、高温热解)、化学法(酸法、碱法)、生物降解法(酶法等)[4]。研究表明，在纤维素经生物酶降解的过程中，反应条件方便控制，反应过程温和，并且没有产生有毒污染物[5]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米秸秆(长春市小合隆)、市售纤维素酶(和氏璧生物工程有限公司，75 000 μ/g)、3，5-二硝基水杨酸试剂、盐酸稀溶液、氢氧化钠稀溶液。

还原糖标准储备液：利用电子秤精确地称取1 g还原糖并移至1000 mL的容量瓶中，将溶质利用一定量的蒸馏水搅拌溶解后定容至刻度，制成1 mg/mL的还原糖标准储备液，保存备用。

还原糖标准使用液：分别取还原糖标准储备液(1 mg/mL)20、40、60、80 mL置于100 mL容量瓶中，配制成0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL的标准使用液，封存备用。

1.2 实验仪器

PTY-A220型电子秤：华志电子科技有限公司；pH计：上海仪电科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；电热恒温水浴锅：扬州昌哲试验机械有限公司；扫描电镜：日本岛津。

1.3 实验方法

1.3.1 玉米秸秆降解

分别称取粉碎后的玉米秸秆1 g，倒入烧杯，加入蒸馏水50 mL，再分别加入纤维素酶，在酶解温度、酶解时间、pH值变化的条件下进行酶降解，然后吸取1 mL酶降解液，加入DNS试剂后利用紫外分光光度计测定OD值，再代入公式计算还原糖浓度[6-8]。

1.3.2 标准工作曲线建立

分别移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL酶降解液于15 mL的玻璃试管中，使用移液枪添加蒸馏水,补足至1 mL后在每支玻璃试管中准确加入2 mL的DNS试剂，放置于备好的沸水中加热，5 min后取出，利用流水冷却。从每支玻璃试管中各取1 mL，加9 mL的去离子水，然后在540 nm波长下分别测定OD值。以测定的吸光度OD值为纵坐标、还原糖浓度(mg/mL)为横坐标[9]，绘制实验的标准工作曲线，见图1。

图1 还原糖标准曲线

1.3.3 单因素实验

各影响因素的取值范围：酶解温度为40、45、50、55、60 ℃；pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0；酶解时间为100、110、120、130、140 min；酶用量为0.08、0.09、0.10、0.11、0.12 g。

1.3.4 响应面试验

根据单因素实验结果，进行响应面试验设计[10-12]，还原糖浓度为秸秆降解效果的响应值，A代表pH值、B代表酶解时间、C代表酶解温度、D代表酶量，将其设定为4个考察因素，确定因素水平编码见表1。

表1 因素水平编码表

2 结果与分析

2.1 还原糖的测定

根据回归方程：y=0.6939X+0.0022，R2=0.9969，测定还原糖浓度。

2.2 影响玉米秸秆降解的因素分析

2.2.1 优化纤维素酶的酶解温度对降解玉米秸秆的影响

从图2可以看出，酶解温度对玉米秸秆降解的效果较为显著。在温度低于55 ℃时，随着温度上升，秸秆降解中还原糖浓度曲线趋向上升；当酶解温度达到55 ℃时，还原糖浓度出现最佳值；温度超过55 ℃后，还原糖浓度曲线开始下降，可能是由于温度过高使纤维素酶逐渐失活。

图2 酶解温度对秸秆降解还原糖浓度的影响

2.2.2 优化纤维素酶的酶解pH值对降解玉米秸秆的影响

在酶解的温度、时间等用量和酶条件保持不变时，只调整pH值，从图3可以看出，还原糖浓度先升后降，曲线呈抛物状，表明优化的酶解pH值对降解有较好的作用。从曲线形态来看，在pH值小于5.5的情况下，还原糖浓度逐渐上升；在pH值等于5.5时，还原糖浓度达到最高值；随着pH值逐渐偏向中性时，还原糖浓度开始降低。因此，以酯活力为75 000 μ/g的纤维素酶降解玉米秸秆，pH值为5.5较适宜。

图3 pH值对秸秆降解还原糖浓度的影响

2.2.3 优化纤维素酶的酶解时间对降解玉米秸秆的影响

从图4可以看出，酶解时间对秸秆降解过程中还原糖浓度有较大影响。在酶解温度、酶用量、酶解pH值都保持不变时，酶解时间小于120 min时，还原糖浓度逐渐增加；在酶解时间为120 min时，还原糖浓度达到最高值；当酶解时间大于120 min时, 还原糖浓度逐步下降。因此，酶解时间在120 min时，降解效果最好。

2.2.4 优化纤维素酶的添加量对降解玉米秸秆的影响

从图5可以看出，降解过程中以纤维素酶加入量为0.1 g时出现的峰值为节点，以每0.01 g的量继续添加，还原糖浓度随着添加量的增加不断上升，含量达到0.161 mg/mL。当纤维素酶的加入量达到一定值后，还原糖浓度出现逐渐降低的现象。因此，75 000 μ/g 纤维素酶降解效果以酶用量0.10 g/g秸秆为宜。

图4 酶解时间对秸秆降解还原糖浓度的影响

图5 酶用量对秸秆降解还原糖浓度的影响

2.3 响应面法优化试验设计

2.3.1 响应面法优化试验

选用Design-Expert 8.0.6 软件设计响应面试验[13]，以还原糖浓度为响应值Y，试验结果见表2，方差分析见表3。将获得的数据进行拟合分析，得到一个二次多元回归方程。该方程可以预测给定区间内还原糖的浓度，分析得到回复方程的复相关系数R2=0.9355, 校正后的复相关系数R2=0.8562。

Y=0.16+0.001917A-0.00125B-0.00017C+0.004D-0.0005AB-0.00325AC-0.002AD+0.00025BC-0.001BD+0.0015CD-0.01541A2-0.01316B2-0.016C2-0.014D2

表2 正交试验结果

续表2:

根据表3，试验所得模型对玉米秸秆降解的影响较显著(P<0.01)；试验误差较小，未知因素对此次试验结果的干扰近似忽略，失拟项中P>0.05，差异不显著；R2=0.9355，表明该模型能够反映还原糖浓度的响应情况，拟合的情况适合该试验，利用该模型分析还原糖浓度可行。

2.3.2 响应面工艺优化分析

选用Design-Expert 8.0.6软件的降维分析，得到等高线图和响应面图，可以据此判断各因素之间的交互作用。

图6中的等高线呈椭圆形，响应面图中曲面呈抛物面状，可见酶解pH值和时间对还原糖浓度有较大的影响。当pH值一定时，秸秆与纤维素酶反应时间越长，还原糖浓度的值越大；当反应时间达到120分钟时，抛物线出现峰值；超过120分钟后，随着时间增加，还原糖浓度越来越低。当反应时间保持不变时，曲面随着pH值的加大而趋向上升；当pH值大于5.5时，曲线开始下降。综合来看，酶解时间与pH值之间的作用对秸秆降解有显著的影响。

表3 还原糖浓度方差分析

图6 酶解PH值与时间对降解玉米秸秆中还原糖浓度的响应面图

图7中等高线呈明显的椭圆形，响应面图呈抛物状，表示pH值及温度在秸秆降解的过程中交互作用极为显著。当pH值一定时，随着温度逐渐上升，还原糖浓度明显提高；当温度高于55 ℃时，抛物线开始降低；当温度恒定、pH值为5.5时，曲线出现峰值；当pH值小于5.5时，抛物线逐渐上升；当pH值大于5.5时，抛物线开始下降。由此可见，最适温度为56 ℃左右、最适pH值为5.5时，两者的交互作用对秸秆降解的作用明显。

图8中的等高线呈椭圆形，表明酶用量与酶解pH对秸秆降解的影响显著。当pH值一定时，酶用量在0.09～0.10 g，还原糖量随酶用量的增加而逐渐增加，在0.1 g时达到最大值；酶用量在0.1～0.11 g，抛物线趋于平缓并下降。因此，加入适当数量的酶可以提高秸秆的降解率。当酶的添加量一定时，pH值对还原糖浓度影响呈抛物线状。随着溶液pH值的升高，还原糖浓度先升高后降低，在pH值为5.5左右达到最大值。

图9中的等高线呈椭圆形，交互影响图呈明显的抛物状。酶解温度、时间对秸秆降解的作用明显，对还原糖浓度有较大的影响。当时间一定时，随着温度升高，还原糖浓度逐渐提高，且还原糖浓度在55～56 ℃时达到最高值；当温度不变时，随着酶解时间的增加，抛物线先上升后降低。可见，温度在降解中的作用大于时间的作用。

图7 酶解pH值与温度对降解玉米秸秆中还原糖浓度的响应面图

图8 酶解pH值与酶用量对降解玉米秸秆中还原糖浓度的响应面图

图9 酶解温度与时间对降解玉米秸秆中还原糖浓度的响应面图

图10中的等高线呈较明显的圆形，说明纤维素酶的加入量与时间之间的相互作用不强。当反应时间一定时，抛物线随着酶用量的增加而逐渐升高；当酶的加入量超过0.1 g时，还原糖浓度出现降低趋势。当酶的加入量不变时，还原糖浓度随酶解时间的增加先升高后趋于稳定，在120 min时达到最高值。两个因素对秸秆降解的相互作用不明显。

根据图11，等高线与交互影响的响应面图对还原糖浓度的交互作用的显著性较小。等高线趋于圆形，表明交互的作用小。当酶的加入量在0.09～0.1 g时，抛物线不断上升；酶的加入量>0.1 g时，抛物线逐渐降低。当酶的添加量不变时，抛物线随着温度升高而上升；在55～56 ℃时，还原糖浓度出现峰值；温度持续升高，还原糖浓度开始变小。

图10 酶解时间与酶用量对降解玉米秸秆中还原糖浓度的响应面图

图11 酶解温度与酶用量对降解玉米秸秆中还原糖浓度的响应面图

未被降解的秸秆扫描电镜图 经过纤维素酶酶解的秸秆扫描电镜图图12 秸秆扫描电镜图

2.3.3 反应前后秸秆扫描电镜图对比

根据图12中的左图，未经纤维素酶降解的玉米秸秆中的纤维素分为结晶区和无定形区。在结晶区中，分子链光滑平整，布列整齐、紧密。在纤维素无定形区，分子链排列较松散。右图显示，秸秆降解后表面已经被严重破坏，结晶区与无定形区没有差别,纤维束断裂、粗糙，出现了空化现象。利用纤维素酶降解，对打开秸秆的糖苷键有明显的促进作用，因此可以提高降解率[14]。

2.4 验证实验

利用响应面软件建立秸秆降解的最优条件如下：pH值为5.53,酶解时间为119.47 min，酶解温度为54.98 ℃，酶用量为0.1 g/g秸秆。此时，还原糖浓度达到最大值，为0.160 777 mg/mL。根据响应面所建立的最优降解条件在实际操作中难以控制，故将优化的降解条件调整如下：pH值为5.5，酶解时间为120 min，酶解温度为55 ℃，酶用量为0.1 g/g秸秆。根据调整后的最优条件，进行3组平行验证实验，测定OD值，计算出还原糖的浓度分别为0.162、0.161、0.159 mg/mL，平均值为0.1 606 mg/mL，实际值与响应面建立的拟合较好，从而验证了利用该模型进行秸秆降解的可行性。

3 结论

本研究运用响应面法对市售的这种纤维素酶降解玉米秸秆的条件进行优化，最终确立酶促反应最佳条件如下：pH值为5.5，酶解温度为55 ℃，酶解时间为120 min，酶用量为0.10 g/g秸秆。此时降解后的秸秆中还原糖浓度为0.161 mg/mL。纤维素是取之不尽的天然资源，面对日益严重的能源短缺问题，我们要深入研究可再生能源，积极探索秸秆的处理工艺。