乌饭叶中多酚类物质的提取工艺研究

余 芳，郑 萍，刘晴晴

(江苏经贸职业技术学院 a.健康学院; b.江苏省食品安全工程技术研究开发中心，江苏 南京 211168)

乌饭树是杜鹃花科越橘属植物，又名南烛、乌饭子、染菽等，广泛分布于长江以南各地区，多生长在山坡灌木丛或马尾松林内，属杜鹃花科四季常绿的灌木，其叶子为卵形或椭圆形，秋季开白色花，其浆果为球状，熟时呈紫黑色，味甜可食。每年阴历四月初八，南京地区有用乌饭树叶打成汁水浸泡大米、煮乌米饭食用的传统。唐代陆龟蒙在《道室书事》中有“乌饭新炊笔服香，道家斋日以为常”之语。明代《正德江宁县志》卷2记载：“四月八日吱乌饭。”李时珍在《本草纲目》中称：“乌饭乃仙家服食之法。”乌饭树叶全缘或有锯齿状，表面平坦有光泽，味苦、平、无毒。清代《本草新编》中记载，乌饭叶“益精气，强筋骨，明目，止泄”，是重要的药材，具有抗衰老、抗炎症、改善血液循环等多种药理功效。 中医学认为，乌饭枝叶性味苦、平、无毒，止泄除睡，强筋益气，久服轻身明目，黑发驻颜，可以调补脾肾、舒筋活络、助阳补阴，日常食用对人体有一定的益处。乌饭叶中含有多酚类物质、黄酮、熊果酸、β-谷甾醇、蓝黑色素、对羟基桂皮酸、内消旋肌醇、α-亚麻酸以及钙、钾、锌、铁、锰、铜、锶等大量的微量元素。吴凤桐等从乌饭叶的石油醚提取物中分离鉴定出2种物质结晶：乌索酸(ursolic acid)、齐墩果酸(olanolic acid)。其含有的多酚类物质抗氧化能力很强，具有抗疲劳及延缓衰老的作用。α-亚麻酸具有降低血压、调节血脂、减少血栓的作用，熊果酸有降血糖的作用。

本实验以新鲜乌饭叶为原料，采用单因素实验和正交试验，探索乌饭叶中多酚类物质的提取方法，优化提取工艺，确定最佳工艺参数，为进一步开发利用传统乌饭叶资源提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验原料

乌饭叶，市售当年新叶，5月间采于江苏省南京市江宁区青龙山。

1.2 实验试剂

实验所需试剂见表1。

表1 实验所需试剂

1.3 主要设备

BSA224S电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司； SHA-C电热恒温水浴锅，上海路达实验仪器有限公司；JH722可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；DS-1高速组织捣碎机，上海精密仪器仪表有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 试样制备

当日采摘新鲜乌饭叶，洗净叶面灰尘后，自然沥水至叶面无水分残留，分装入塑料包装袋，于冰箱中冷藏备用。

1.4.2 标准溶液的配制

酒石酸铁溶液的配制：准确称取1 g硫酸亚铁和5 g酒石酸钾钠，将所称取固体放入烧杯，加适量蒸馏水溶解，分次转入1000 mL容量瓶，稀释定容至刻度。

pH 7.5磷酸缓冲液的配制：准确称取60.20 g磷酸氢二钠和5 g磷酸二氢钠，将所称取固体放入烧杯，加适量蒸馏水溶解，分次转入1000 mL容量瓶，稀释定容至刻度。

1.4.3 多酚含量的测定

准确吸取不同处理条件下提取过滤后获得的待测液体4 mL(需现配现用)，分别放入100 mL容量瓶，再吸取16 mL蒸馏水、20 mL酒石酸铁溶液，用磷酸缓冲液定容至刻度线处。同时做一个空白样，准确吸取20 mL蒸馏水和20 mL酒石酸铁溶液放入100 mL容量瓶，用磷酸缓冲液定容至刻度线。放置10 min后，将1 cm的玻璃比色杯置于540 nm处，测定其吸光度。根据吸光度等于1时，多酚含量为7.826 mg计算：

多酚(%)=[(A×7.826)/103]×[T/(V×M)]×102

其中：A——样液的吸光度，T——供试液总量(mL)，V——吸取的样液量(mL)，M——样品质量(g)。

1.5 单因素实验

准确称取乌饭叶10 g，适当剪碎，加适量溶剂，经高速组织捣碎机捣碎，待提取多酚类物质。通过单因素实验，考察料液比、乙醇体积分数、水浴提取温度、提取时间对乌饭叶多酚类物质得率的影响。

1.5.1 料液比

按照料液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40(g/mL)，乙醇体积分数50%，提取时间30 min，水浴提取温度60 ℃，测定乌饭叶多酚类物质得率。

1.5.2 乙醇体积分数

设定乙醇体积分数为20%、30%、40%、50%、60%，料液比为1∶10，提取时间为30 min，水浴提取温度为60 ℃，测定乌饭叶多酚类物质得率。

1.5.3 提取时间

设定提取时间为0.5、1、1.5、2、2.5 h，料液比为1∶10，乙醇体积分数为30%，水浴提取温度为60 ℃，测定乌饭叶多酚类物质得率。

1.5.4 提取温度

设定水浴提取温度为40、50、60、70、80 ℃，料液比为1∶10，乙醇体积分数为30%，提取时间为30 min，测定乌饭叶多酚类物质得率。

1.6 正交试验

在单因素实验的基础上，以料液比、乙醇体积分数、水浴提取时间、提取温度作为考察的 4个因素，每因素设置 3个水平，进行 L9(34)正交试验优化提取条件，确定最佳提取工艺，见表2。

表2 正交试验因素水平表

1.7 数据处理

测定结果均平行重复3次(n=3)，取其平均值。

2 结果与分析

2.1 提取条件对多酚类物质得率的影响

2.1.1 料液比对多酚类物质得率的影响

如图1所示：当料液比为1∶5时，在水浴提取过程中乙醇蒸发损失，导致可能存在料液比误差，提取液过滤后获得的样液很少，在此过程中由于提取液被浓缩而显示吸光值虚高；当料液比增加到1∶10、1∶20、1∶30、1∶40后，吸光值呈现先增后减的趋势，1∶40时已处于下降状态，且料液比越大，多酚类物质的提取得率越低。因此选择料液比1∶10、1∶20、1∶30作为正交试验的三个试验水平。

图1 料液比对多酚类物质得率的影响

2.1.2 乙醇体积分数对多酚类物质得率的影响

如图2所示：随着乙醇体积分数的增大，多酚类物质的溶解度不断增大，多酚类物质得率呈现上升趋势；当乙醇体积分数为30%～50%时，多酚类物质的溶解度达到较高状态，60%后呈下降趋势，溶解度降低。因而选择乙醇浓度30%、40%、50%作为正交试验乙醇体积分数的三个试验水平。

图2 乙醇体积分数对多酚类物质得率的影响

2.1.3 提取时间对多酚类物质得率的影响

由图3可知，在提取时间为1.5～2.5 h时，随着提取时间的延长，乌饭叶中多酚类物质得率直线提升，可见反应时间越长，提取越充分。但考虑提取时间越长，多酚类物质越容易被氧化，对试验结果影响程度较大，因此选择1、1.5、2 h作为正交试验提取时间的三个水平。

图3 提取时间对多酚类物质得率的影响

2.1.4 提取温度对多酚类物质得率的影响

由图4可知，随着水浴提取温度的升高，多酚类物质的溶解度不断增大，多酚类物质得率一直处于上升状态，但温度越高，提取溶剂乙醇溶液的蒸发速度越快，极易造成料液比的误差和提取液的浓缩，从而导致吸光值虚高。因此选取60、70、80 ℃作为正交试验提取温度的三个水平。

图4 提取温度对多酚类物质得率的影响

2.2 正交试验结果

对单因素实验结果进行极差分析，以确定最佳提取条件。以料液比(A)、乙醇体积分数(B)、提取时间(C)、提取温度(D)作为4个考察因素，选取3个水平进行L9(34)正交试验。每一水平K1、K2、K3中的最大值所对应的条件即为该因素对应的最佳提取条件。正交试验结果见表3。

由表3可知，提取乌饭叶中多酚类物质的最佳工艺条件为A1B3C3D3，即料液比1∶10 g/mL、乙醇体积分数 50%、提取时间2 h、提取温度 80 ℃。4个因素对乌饭叶中多酚类物质得率的影响大小依次为：A>B>C>D。其中料液比A的提取作用最为显著。

表3 L9(34)正交试验结果

续表3：

影响乌饭叶中多酚类物质得率的主要因素有液料比、超声波辅助提取、浸提温度、浸提时间和提取次数等。

余清采用醇提法提取乌饭叶多酚类物质，通过单因素实验及正交试验确定了最佳提取工艺为浸提温度75 ℃、乙醇浓度50%、固液比1∶40、提取时间2 h、提取2次。方差分析结果表明固液比和提取时间对多酚类物质的提取效果影响极显著，确证实验表明该条件下乌饭叶提取液中多酚含量达11.36%。

王芳等通过响应面分析法优化乌饭叶黄酮、多酚的提取工艺。结果表明，乌饭叶黄酮、多酚的最佳提取工艺条件为提取溶剂50%乙醇，料液比1∶41，提取时间50 min，提取温度83 ℃，该条件下黄酮、多酚类物质得率分别为33.4、23.5 mg/g。

陈瑞娇对乌饭树叶多酚的超声波辅助提取最佳工艺及其抗氧化活性进行研究。结果表明，乌饭树叶多酚超声波辅助提取最佳工艺条件为超声温度75 ℃、超声时间40 min、料液比1∶30(g/mL)，在此条件下乌饭树叶多酚提取量可达71.01 mg/g。

3 结论

采用单因素实验和L9(34)正交试验，以料液比(A)、乙醇体积分数(B)、提取时间(C)、提取温度(D)作为4个考察因素，选取3个水平进行试验，得出提取乌饭叶中多酚类物质的最佳工艺条件为：料液比1∶10(g/mL)、乙醇体积分数 50%、提取时间2 h、提取温度 80 ℃。该试验条件下乌饭叶提取液中的多酚类物质得率为13.0%。四个因素对乌饭叶中多酚类物质得率的影响大小依次为：A>B>C>D。即料液比>乙醇体积分数>提取时间>提取温度。

4 展望

乌饭树主要产于我国浙江、江苏、福建等长江以南地区。乌饭叶的食用方法以现采鲜食为主。乌饭叶在提取过程中所含有的多酚类物质容易氧化，因此不易保存，其综合利用引起了很多学者的关注。肖珊美以乌饭叶为原料，通过浸渍提取汁液、浓缩、制粒、干燥等方法制得颗粒剂保健品。唐旭东等申请了制备乌饭叶茶的专利，将乌饭树叶蛋白酶解产物与乌饭树叶茶粉混合、包装、杀菌，制得降血压乌饭树叶袋泡茶产品。邵京等公开了乌饭叶酿制糯米酒的专利，以乌饭叶和糯米为主要原料，经过原料预处理、乌饭叶提取液制备、灭菌、浸米、 煮制、配制、主发酵、后发酵、分离，最后制得产品。谭小丹等用乌饭叶制成的防腐物质，不仅可用于食品加工之中，还可以作为天然食品添加剂使用。因此，无论是从药用价值还是食疗保健的角度，乌饭叶研究开发都具有广阔的市场应用前景，能产生较大的经济效益和社会效益。