LncRNA-XIST/miR-137/Notch1在糖尿病视网膜病变患者血清和玻璃体中的表达及机制

许瑶 娄静 赵峰

1苏州大学附属第一医院眼科（江苏苏州215000）；2苏州市独墅湖医院眼科（江苏苏州215000）；3中山大学中山眼科中心（广州510060）

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的一种血管并发症，糖尿病通过破坏包含血视网膜屏障（BRB）的内皮细胞（endothelial cells，ECs）之间的紧密连接，导致视网膜血管重塑异常新生血管形成［1］。研究表明，高血糖可促进血管内皮细胞的增殖和迁移，加速血管内皮细胞的形成［2］。因此，调节ECs 功能可能为DR 的治疗提供一种新的治疗策略。

在DR 病变中，NOTCH1 信号紊乱导致血视网膜屏障被破坏，因此，NOTCH1 在维持健康视网膜屏障功能中的重要作用［3］。有研究表明miR-137启动子甲基化在DR 的发生发展中也起到了重要作用［4］。抑制miR-137 基因表达可减弱高糖诱导的内皮细胞增殖抑制和凋亡促进作用［5］。研究表明长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNAs）与2 型糖尿病及其相关的肾和视网膜并发症相关［6-7］。也有研究表明在糖尿病和糖尿病相关微血管并发症中lncRNAs 存在异常表达［8-9］。长链非编码RNA XIST（lncRNA-XIST）是位于X 染色体失活中心的基因的转录产物，研究发现其表达失调会与多种疾病的发生密切相关［10］，但在DR 中的研究尚无报道，这也是本研究的重要目的。

本文通过研究lncRNA-XIST/miR-137/Notch1在糖尿病视网膜病变患者血清和玻璃体中的表达。探讨lncRNA-XIST 可能在调节全身葡萄糖稳态和DR 发展中发挥重要作用及其可能的机制，为DR 的治疗提供一种新的诊疗策略。

1 资料与方法

1.1 一般资料本文收集了我院糖尿病视网膜病变患者（n=12），作为试验组。对照组分为正常玻璃体对照组（n= 12）和正常血清对照组（n= 12）。本研究经苏州大学附属第一医院伦理审查委员会批准，并签署知情同意书。

1.2 细胞培养和转染人视网膜微血管内皮细胞（Human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs）购于American Type Culture Collection（ATCC），HRMECs 在内皮细胞培养基（Endothelial medium，ECM）中与5%胎牛血清、1%内皮细胞生长补充剂和1%青霉素/链霉素溶液在37 ℃和5%CO2下培养。lncRNA-XIST、silncRNA-XIST、miR-137、silncRNA-XIST 和negative 使 用Lipofectamine 3000 转染HRMECs。转染48 h 后，用30 mmol/L 葡萄糖作为高糖模型，备用。

1.3 RNA 提取与qRT-PCR总RNA 用lncRNA和miRNeasy 小试剂盒（中国北京天根生物科技公司）提取。用cDNA 合成试剂盒（中国北京天根生物科技公司）反向转录，用带有gDNA 橡皮擦的PrimeScript RT 试剂盒（Takara，Kusatsu，Japan）反向转录RNA，并用TB-Green 预混物Ex-Taq-II（Takara）进行扩增。分别用U6（天根生物科技）为lncRNA和miRNeasy 的内对照。PCR 扩增条件：94 ℃预变性5 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40 个循环后72 ℃充分延伸10 min，用2-△△Ct法分析定量结果。实验中lncRNA-XIST 上游引物为“CGGGTCT CTTCAAGGACATTTAGCC”，下游引物为“GCACCAATACA GAGGAATGGAGGG”；miR-137 上游引物为“GAA ATC CGA CAG CTT AAG GAG GTT TGA”，下游引物为“CAT TGC ACA GAT AGG ATT TGA TTT ACT”。

1.4 Western blot试验组、正常玻璃体对照组和正常血清对照组三组中样品用蛋白质提取试剂盒（Qiagen）提取蛋白质后BCA 法检测蛋白浓度。上样后进行SDS-PAGE 电泳，120 V 电泳1 h，电泳结束后将目的蛋白转移到PVDF 膜（100 V 1 h），封闭液中室温孵育1 h。使用主要抗体包括多克隆anti-Notch1 抗体（1 000∶1）和anti-GAPDH 抗体（1 000∶1）在4 ℃条件下孵育过夜后，TBST 洗膜3 次，使用抗兔二抗IgG 在37 ℃条件下孵育2 h。用ECL 增强化学荧光试剂（Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）和ChemiDoc XRS 系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）观察表达，Image J 图像分析系统对蛋白条带进行分析。

1.5 细胞增殖实验验和ELISA 实验细胞计数试剂盒-8（CCK-8）用于检测细胞增殖。分别被lncRNA-XIST、silncRNA-XIST、miR-137、silncRNAXIST 和negative 转染后的HRMECs 细胞按照1 ×105个/mL 铺在96 孔板上，待每孔细胞密度生长至70% ～80%后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液。37 ℃孵育4 h 后，在450 nm 处测定吸光度值。按照ELISA 试剂盒的使用步骤检测ROS、GSH、GSH-px、SOD 和MDA 水平，在450 nm 处测定吸光度值。ROS 染色用DM5000B显微镜（Leica biosystems，Wetzlar，德国）观察细胞。

1.6 荧光素酶报告分析法将含有野生型或突变型miR-20b-5p 结合位点的BAMBI 序列3′UTR 插入pmiR-RB 报告载体（ribbio）的XhoI 和NotI 限制位点。将含有野生型或突变型miR-20b-5p 结合位点的circDNMT3B 序列插入psi-CHECK2 载体（Geneseed）的SgfI 和NotI 限制位点。pmiR-RB 报告和psiCHECK2 向量的地图如补充图S1 所示。使用Lipofectamine 3000（生命技术）将荧光素酶报告载体与miR-20b-5p 模拟物或miR 模拟物NC 共转染293T 细胞。转染后48 h，根据制造商的说明，使用Synergy H4 多模式阅读器（BioTek，Winooski，VT，USA）使用双荧光素酶报告分析系统（Promega，Madison，WI，USA）检测荧光素酶活性。miRNA 在RNA 序列上的结合导致肾素荧光素酶（Rluc）表达降低，影响荧光素酶活性。

1.7 统计学方法使用GraphPad Prism 软件7.0 版进行统计分析。数据用平均值±标准差表示。采用t检验比较两组间的统计学差异。采用单因素方差分析和Bonferroni 多重比较进行多重比较。P ＜0.05 为差异具有统计学意义。每个分析至少进行3 个独立实验。

2 结果

2.1 lncRNA-XIST/miR-137 在糖尿病视网膜病变患者血清和玻璃体中的表达在糖尿病视网膜病变患者中，血清和玻璃体中lncRNA-XIST的表达量明显低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05，图1A、1B）。同时，在糖尿病视网膜病变患者中，血清和玻璃体中miR-137 的表达水平均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05，图1C、1D）。

图1 lncRNA-XIST/miR-137 在糖尿病视网膜病变患者血清和玻璃体中的表达Fig.1 Expression of lncRNA-XIST/miR-137 in serum and vitreous of patients with diabetic retinopathy

2.2 lncRNA-XIST 通过ROS 水平调控视网膜细胞增殖见图2A，lncRNA-XIST 质粒提高视网膜细胞中lncRNA-XIST 的表达水平，差异均有统计学意义（P＜0.05）。lncRNA-XIST 表达的提高能够促进视网膜细胞增殖，减少ROS 和MDA 的水平，增加GSH、GSH-PX 和SOD 水平，差异均有统计学意义（P＜0.05，图1B-G）。silncRNA-XIST 抑制视网膜细胞中lncRNA-XIST 表达水平，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2H。下调lncRNAXIST 发现，视网膜细胞增殖被抑制，ROS 和MDA的表达水平提高，GSH、GSH-PX 和SOD 的表达水平受到抑制，差异均有统计学意义（P＜0.05，图1I-N）。

2.3 miR-137 是lncRNA-XIST 重要靶点见图3A，miR-137 与lncRNA-XIST 结合位点。miR-137+lncRNA-XIST 减少荧光素酶表达量，差异均有统计学意义（P＜0.05，图3B）。提高lncRNA-XIST 表达水平抑制了视网膜细胞的miR-137 表达量，下调lncRNA-XIST 后下调视网膜细胞中miR-137 的表达水平明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05，图3C、D）。

2.4 miR-137 通过ROS 水平调控视网膜细胞增殖见图4A，miR-137 质粒激活视网膜细胞中miR-137 表达量，差异均有统计学意义（P＜0.05）。上调miR-137 抑制视网膜细胞的增殖，提高了ROS 和MDA 的水平，减少GSH、GSH-PX 和SOD 水平，差异均有统计学意义（P＜0.05，图4B、G）。见图4H，si-miR-137 中miR-137 的表达量显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。si-miR-137 组中，视网膜细胞增殖能力得到增强，ROS 和MDA 的水平受到抑制，GSH、GSH-PX 和SOD 水平也被激活，差异均有统计学意义（P＜0.05，图4I、N）。

2.5 Notch1 是miR-137 重要靶点见图5A，Notch1 与miR-137结合位点。miR-137+ Notch1 减少荧光素酶表达量，差异均有统计学意义（P＜0.05，图5B）。激活lncRNA-XIST 提高了视网膜细胞的Notch1 蛋白表达水平，下调lncRNA-XIST 降低了视网膜细胞的Notch1 蛋白表达量，差异均有统计学意义（P＜0.05，图5C、D）。同时，上调miR-137 抑制视网膜细胞的Notch1 蛋白表达量，下调miR-137 后视网膜细胞的Notch1 蛋白表达量得到提高，差异均有统计学意义（P＜0.05，图5E、F）。

图2 LncRNA-XIST 通过ROS 水平调控视网膜细胞增殖Fig.2 LncRNA-XIST regulates retinal cell proliferation through ROS levels

图3 miR-137 是LncRNA-XIST 重要靶点Fig.3 miR-137 is an important target of LncRNA-XIST

3 讨论

糖尿病视网膜病变主要由长期有害的高糖暴露引起，导致血管通透性增加、血管管破坏和血-视网膜屏障（BRB）破裂［11］。ECs 具有紧密的连接是维持内部BRB 的必要条件，其损伤导致血管通透性增加［12］。本研究DR 患者中，lncRNAXIST 表达被抑制，miR-137 表达被激活。激活lncRNA-XIST 能够促进视网膜细胞增殖，减少了ROS 和MDA 的水平，增加GSH、GSH-PX 和SOD 水平。表明，lncRNA-XIST 可以调控ROS 诱导DR 氧化应激损伤。

图4 miR-137 通过ROS 水平调控视网膜细胞增殖Fig.4 miR-137 regulates retinal cell proliferation by ROS levels

图5 Notch1 是miR-137 重要靶点Fig.5 Notch1 is the important target of miR-137

研究表明lncRNA-MEG3 的高表达可通过抑制TGF-β1 和VEGF 的表达而抑制糖尿病视网膜病变的发展［13］。也有研究表明lncRNA HOTTIP 通过p38 MAPK 途径改善糖尿病视网膜微血管病变，LncRNA HOTTIP 有望成为治疗糖尿病微血管病变的新靶点［14-15］。本研究中提高lncRNA-XIST 表达水平抑制了视网膜细胞的miR-137 表达量，下调lncRNA-XIST 后下调视网膜细胞中miR-137 的表达水平明显升高，提示miR-137 是lncRNA-XIST 调控DR 的重要靶点。这与已有研究中在糖尿病条件下，下调的长非编码核旁蛋白组装转录本1 通过升高miR-497 降低脑源性神经营养因子的表达，从而促进Müller 细胞凋亡，加重糖尿病视网膜病变的结果相似［16］。

研究发现miR-137 过表达可使ECs 增殖活性显著降低，高糖环境下增殖活性进一步降低，说明miR-137 过表达可调节ECs 的生物学功能，降低增殖活性和迁移能力［17-18］。本次研究表明，激活miR-137 能够抑制视网膜细胞增殖，提高了ROS和MDA 的水平，减少GSH、GSH-PX 和SOD 水平。这显示，lncRNA-XIST/miR-137 可能调控DR 疾病中ROS 诱导的氧化应激损伤。抑制Notch1 信号触发细胞产生ROS，导致最后细胞死亡，进一步损害组织活动［19-20］。研究发现Notch1 能够通抑制ROS水平，减少视网膜内皮细胞死亡，可保护DR［21］。本研究发现激活lncRNA-XIST 能够激活视网膜细胞的Notch1 蛋白表达量。说明，LncRNA-XIST/miR-137/Notch1 在DR 病变患者血清和玻璃体中发挥着重要作用。

总之，本研究首次发现lncRNA-XIST/miR-137/Notch1 可能通过ROS 水平及其氧化应激来参与糖尿病视网膜病变，具有潜在治疗和诊断靶点，为以后的相关研究提供实验依据。然而本研究中的获取的样本量较少，后续研究中，笔者尝试对LncRNA-XIST/miR-137/Notch1 参与糖尿病视网膜病变做深入探究，了解LncRNA-XIST/miR-137对糖尿病视网膜病变的调控是否涉及其他通路。