LncRNA MIR4435-2HG在HCT-116细胞株的顺铂耐药中的作用机制

邱 杨 骆 萍 吴书贵 钟晓鸣

结肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一[1]。大多数转移性结直肠癌患者仍无法治愈，结肠癌联合化疗的阳性反应率仅为20%～47%，大多数患者容易复发[2]。顺铂广泛用于多种癌症的治疗[3]，然而经常在给药一段时间有效反应后常出现耐药，其具体机制仍不清楚[4]。有研究表明长非编码RNA(LncRNA)与染色质调节蛋白、RNA结合蛋白和小RNA相互作用形成功能复合物，调节多个重要的生命过程[5]。为了研究LncRNA MIR4435-2HG在顺铂耐药中的作用，破坏了顺铂耐药细胞株HCT-116R中MIR44535-2HG的表达，这些耐药细胞株又对顺铂变得敏感，同时发现mRNA中Nrf2和HO-1表达水平也下降了。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和试剂

结肠癌细胞株HCT-116购自美国模式培养物集存库ATCC(Manassas，VA，USA)，从HCT-116对顺铂敏感的细胞株中建立顺铂耐药HCT-116R细胞株。HCT-116和HCT-116R细胞株在McCoy's 5A培养基(Gibco，Life Technologies，USA)中以单层保持，McCoy's 5A培养基主要在37 ℃加湿5%CO2环境中，含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 μg/ml)。MIR4435-2HG siRNA购自中国Thermo Fisher，用Lipofectamine 2000转染剂进行siRNA转染。

1.2 细胞增殖试验

使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(购置日本)，通过WST-8测定评估细胞增殖。将HCT-116细胞株接种在96孔板中并孵育24 h。并将细胞株分别于加或不加25 μm顺铂在McCoy's 5A培养基中培养24 h，每个处理为一式三份进行。孵育后向每个孔中加入10 μl CCK-8试剂，并将板放在37 ℃含5%CO2环境中孵育4 h，然后用酶标仪在450 nm的波长处测量光密度。

1.3 总RNA分离和实时荧光定量PCR分析

根据说明，使用TrizolReagent(Invitrogen，Carlsbad，CA)从处理的细胞中分离总RNA。通过分光光度计(Beckman，Brea，CA)和凝胶电泳分别测定RNA浓度和质量。使用总体积20 ml的M-MLV逆转录酶试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)合成第1条cDNA链。使用SYBR Green一式三份进行基因表达实时荧光定量(qRT-PCR)分析。使用的引物序列是MIR4435-2HG正向：5'-CGGAGCATGGAACTCGACAG-3'，MIR4435-2HG反向：5'-CAAGTCTCACACATCCGGGC-3;Nrf2正向：5'-TACTCCCAGGTTGCCCACA-3'，Nrf2反向：5'-CATCTACAAACGGGAATGTCTGC-3 ';HO-1正向：5'-CACGCATATACCCGCTACCT-3'，HO-1反向：5'-AAGGCGGTCTTAGCCTCTTC-3';GAPDH正向：5'-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3'，GAPDH反向：5'-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3'。

1.4 Caspase-3活性测定

将细胞以5000的密度接种到96孔板中并使其生长24 h。然后根据说明书用Lipofectamine RNAiMAX(ThermoFisher，China)转染靶向MIR4435-2HG的siRNA，24 h后收集细胞，用Caspase-3 Assay Kit(比色法)测定半胱天冬酶活性(Abcam ab39401，Cambridge，UK)。

1.5 统计学方法

数值表示为均值±标准差，使用Prism Graphpad 6.0进行统计学分析，P<0.05时统计学存在显著性差异。

2 结果

2.1 HCT-116、HCT-116R细胞株对顺铂的敏感性及MIR4435表达水平

首先，我们通过3个月在HCT-116中添加25 μm顺铂来诱导HCT-116对顺铂的耐药性，我们将其命名为HCT-116R。HCT-116R细胞株可以在25 μm顺铂的情况下增殖，而大多数HCT-116敏感细胞逐渐死亡(图1A)。通过检测对顺铂的反应，然后使用RNA-Seq分析HCT-116和HCT-116R的改变的细胞转录组，研究发现LncRNA MIR4435-2HG水平显著增加了约10倍，并且结果通过实时荧光定量PCR的验证(图1B)。

注：A，用25 μm顺铂处理HCT116和HCT116R细胞，并在0，8和24 h后通过WST测定测试细胞活力。B，通过实时荧光定量PCR检测HCT-116和HCT-116R中的lncRNA MIR4435-2HG水平。

2.2 敲除MIR4435-2HG的HCT-116R对顺铂的敏感性

为了研究LncRNA MIR4435-2HG与顺铂耐药性的关系，我们通过siRNA敲除siRNA HCT-116R的LncRNA MIR4435-2HG，并且通过实时荧光定量PCR验证了siRNA的MIR4435-2HG水平显著降低(图2A)。通过siRNA敲除MIR4435-HG2增加HCT-116R对顺铂的敏感性，并且通过WST测定测试细胞活力，在存在25 μm顺铂的情况下，针对MIR4435-2HG的siRNA抑制HCT-116R的增殖，而siRNA的碱基错配序列没有显著影响(图2B)。敲除MIR4435-2HG后，顺铂使casepase-3活性增加约2倍(图2C)，这也表明HCT-116R的凋亡。

注：A.通过siRNA在HCT116R中敲除lncRNA MIR4435-2HG，并通过实时荧光定量PCR验证siRNA的作用。B.通过siRNA敲除MIR4435-HG2增加HCT-116R对顺铂的敏感性，并且在顺铂给药后0，8和24 h通过WST测定测试细胞活力。C在顺铂治疗后24 h后测试casepase-3活性。*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001。

2.3 敲除MIR4435-2HG对与氧化损伤相关Nrf2和HO-1的mRNA水平的影响

转录因子NF-E2相关因子(Nrf2)是细胞防御化学/氧化应激的重要调节因子，血红素加氧酶-1(HO-1)是Nrf2调节基因，在预防炎症中起关键作用。在25 μm顺铂处理后，MIR4435-2HG siRNA的转染显著下调了Nrf2和HO1的mRNA水平(图3)，表明MIR4435-2HG的作用涉及氧化应激。

注：通过实时荧光定量PCR分析了HCT-116R细胞的相对NRF2(A)和HO-1 mRNA(B)水平，并将结果标准化为参考基因GAPDH。*P<0.05。

3 讨论

顺铂被认为可以与DNA中的一些碱基形成共价复合物，然后治愈许多睾丸和一些卵巢癌症[6]。然而，顺铂在结直肠癌的治疗中有效率较低，单独使用或与其他抗癌药物联合使用时临床反应不到20%[7]。最近一些研究表明，lncRNA通过各种不同的机制导致了顺铂耐药[8]。据报道，LncRNA MIR4435-2HG与肝细胞癌[9]和肺癌有关[10]。Ouyang等发现LncRNA-MIR4435-2HG可能通过P38/MAPK和VEGF途径参与结直肠癌的发展[11]。本研究发现与正常细胞株相比，顺铂耐药细胞株中LncRNA MIR4435-2HG水平增加了7～8倍，这表明MIR4435-2HG可能涉及顺铂耐药。然后我们用siRNA敲低MIR4435-2HG水平，在顺铂耐药HCT-116R的细胞中，siRNA抑制约90%的MIR4435-2HG表达。在HCT-116R细胞株中敲除 MIR4435-2HG在顺铂给药24 h导致约1/3的HCT-116R死亡，在对照组中，没有MIR4435-2HG表达破坏的HCT-116R细胞株在24 h增殖约2倍。除此之外，在顺铂处理24 h后，与HCT-116R细胞相比，MIR4435-2HG敲除细胞中caspase-3活性增加2.5倍。而siRNA的碱基错配序列没有显著影响，这表明顺铂诱导的细胞死亡可能主要由细胞凋亡产生。

转录因子NF-E2相关因子(Nrf2)是一种转录因子，对氧化应激反应并在氧化还原稳态中起关键作用[12]。血红素加氧酶(HO)作为Nrf2的下游[13]，是一种催化血红素降解的酶[14]。这两种成分通常在不同类型的肿瘤中表达增加，并与肿瘤进展、侵袭性及对治疗的耐药和预后不良相关[15]。本研究中，MIR4435-2HG的敲除显著降低了NRF2和HO-1 的mRNA水平。

综上，本研究观察到lncRNA MIR4435-2HG为驱动HCT-116细胞株的顺铂耐药的主要因子。此外，lncRNA MIR4435-2HG可能通过Nrf2/HO-1途径参与顺铂耐药的发生。本研究揭示了lncRNA MIR4435-2HG在结直肠癌顺铂耐药中的作用，并提供了顺铂耐药的潜在机制。基于顺铂耐药的机制，通过以下策略来克服未来结直肠癌的耐药性：①开发新的铂类药物;②改善顺铂向肿瘤的递送方式；③特异性靶向顺铂耐药机制；④将顺铂与其他药物结合起来。