液相色谱-串联质谱联用法同时测定6种植物激素

张丹,孙萍,陈思瑾,幸华,芮仕立,牛早霞，栗孟飞

(1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省定西市农业生态与资源保护技术推广站，甘肃 定西 743000)

植物激素是指植物通过自身代谢产生的、在低浓度下即诱发生理效应的有机信号分子，在植物生长发育及环境响应过程中具有重要作用[1].植物激素常被分为内源激素(endogenous hormones)和外源激素(exogenous hormones)两类.内源性植物激素是植物自身代谢产生的一类具有高度生物活性的有机小分子化合物，在植物某一部位合成，然后再转运至其他部位发挥生物学作用；外源植物激素是人工合成的具有植物激素活性的物质，又叫植物生长调节剂.根据生理功能和化学结构的不同，可将植物激素分为：生长素(auxins)[如吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)、吲哚-3-丁酸(Indole-3-butyric acid，IBA)、萘乙酸(Naphthylacetic acid，NAA)等]、细胞分裂素(cytokinins，CTKs)[如玉米素(Zeatin，ZT)、异戊烯基腺嘌呤(isopentenyl adenine，iPAde)、6-苄氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)等]、赤霉素(gibberellins，GAs)、脱落酸(abscisic acid，ABA)、乙烯(ethylene，ETH)、油菜素甾醇(brassinosteroids，BRs)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)及其衍生物和水杨酸(salicylic acid，SA)等8大类[2].

由于植物激素在提高作物产量和品质方面扮演着重要角色，因此对其准确地检测具有重要意义[3].目前，对于植物激素的检测经典方法有：1)生物鉴定法，利用激素作用于植物组织和器官产生特异性反应进行测定；2)免疫检测法，基于抗原和抗体的特异性结合，包括放射免疫测定法、酶联免疫吸附测定法、荧光免疫法等；3)色谱法，利用激素在固定相和流动相上保留性质的差异实现分离和检测，早期主要有纸层析和薄板层析法，现代最常见的方法有气相色谱法(gas chromatography，GC)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)；4)色谱质谱(Chromatography-mass spectrometry,C-MS)联用技术，克服了传统色谱技术在植物激素定性和定量分析方面的不足，将色谱对复杂混合物的分离能力与质谱的高选择性、高灵敏度以及能够直接得到待测物质的结构与相对分子量等特点相结合，已在激素分析等领域得到了广泛应用；其中，LC-MS灵敏度高，选择性强，且可同时测定多种不同激素，是目前激素分析的主流，也是今后的发展趋势[4-6].

基于LC-MS的优势，很多学者就LC-MS同时检测植物激素的方法进行了细致研究与报道.比如，钟冬莲等[7]同时测定了毛竹笋中4种内源性植物激素(GA3、ABA、IAA和IBA)；郭建恒等[8]同时测定了大花罗布麻叶中5种植物激素(GA3、ABA、IAA、IBA和JA)；龚明霞等[9]同时测定了辣椒叶片中7种植物激素(GA1、GA3、GA4、ABA、IAA、ZT和JA).到目前为止，还没有建立针对不同植物种类、同时检测GA3、iPAde、6-BA、IAA、SA和ABA等6种植物激素的LC-MS方法.

1 材料与方法

1.1 试剂

试验所用6种植物内源激素标准品：吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)、赤霉素(gibberellin A3，GA3)、异戊烯基腺嘌呤(isopentenyl adenine，iPAde)、6-苄氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)、脱落酸(abscisic acid，ABA)和水杨酸(salicylic acid，SA)均采自上海源叶生物科技有限公司.乙腈、甲醇、甲酸、无水乙醇均为色谱级(≥98%，HPLC).

1.2 仪器

LC-MS联用仪(Agilent 1290-6460,美国)，色谱柱ZORBAX Eclipse Plus C18(Rapid resolution HD 2.1 mm×150 mm，1.8 μm).

1.3 测定方法

LC条件：检测波长290 nm，柱温35 ℃，流速0.3 mL/min；流动相：B(甲醇)∶A (0.1%甲酸)，采用梯度洗脱：0～1 min 10%～40%(B)、1～2.5 min 40%～45%(B)、2.5～5 min 45%～80%(B)、5～5.1 min 80%～10%(B)、5.1～7.1 min 10%～10%(B)，进样量5 μL.

MS条件：电喷雾电离子源(ESI)，扫描方式为负离子扫描，多反应监测模式，离子源温度350 ℃，干燥气流速11 L/min，雾化器压力35 psi，毛细管电压4 kV，碰撞气为高纯氮气.6种植物激素的质谱具体参数见表1.

表1 6种植物激素的质谱参数

1.4 植物内源激素的提取

植物内源激素的提取参考张玉琼等[10]方法.具体步骤为：首先，称取1.0 g新鲜植物(马铃薯、油菜和苜蓿)叶片，液氮研磨至匀浆后置于15 mL离心管，加入10 mL预冷的甲醇-甲酸溶液(99∶1)；22 ℃超声2 min后置于4 ℃下静置提取12 h；其次，浸提液以10 000 r/min离心10 min，吸取1.0 mL上清液，加入H2O定容至10 mL；然后，用ODS C18固相萃取柱进行上样吸附，用10%甲醇溶液6 mL，分两次淋洗固相萃取柱；最后，用甲醇-甲酸溶液(99∶1) 6 mL进行洗脱，收集的洗脱液经减压浓缩至小体积，用甲醇定容至1.0 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤，用于内源激素的检测.

1.5 定性与定量分析

对分析样品溶液进行LC-MS/MS测定，以各种激素的保留时间和特征离子对为依据进行定性，采用标准曲线进行定量.

2 结果与分析

2.1 标准品独立检测方法的建立

6种激素质量浓度均为10 μg/L，进样量5 μL时，在1.3测定方法条件下，GA3出峰时间为4.42 min、峰面积为283.38(图1-1A和1-1B)；iPAde出峰时间为4.63 min、峰面积为256.78(图1-2A和1-2B)；6-BA出峰时间为4.84 min、峰面积为525.71(图1-3A和1-3B)；IAA出峰时间为5.09 min、峰面积为70.41(图1-4A和1-4B)；SA出峰时间为5.51 min、峰面积为641.50(图1-5A和1-5B)；ABA出峰时间为5.71 min、峰面积为675.65(图1-6A和1-6B).

2.2 标准品同时检测方法的建立

将以上6种激素标准样品(质量浓度10 μg/L)进行混合，进样量5 μL，在相同的色谱条件下进行同时测定，结果见图2.GA3、iPAde、6-BA、IAA、SA和ABA之间分离度较好，各激素基线之间没有重叠，表明该检测方法可同时进行6种激素的检测.

2.3 测定方法的线性范围和检出限

将混合的标准样品配制成梯度浓度，在相同的色谱条件下测定其峰面积，以浓度X(μg/L)为横坐标，色谱峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，并获得相应的线性回归方程及相关系数.表2结果表明：6种植物激素在浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数R2均达到0.99，检出限在1.0～100 μg/L之间，说明本研究方法对植物激素有较高的检测灵敏度.

2.4 同时检测方法在植物样品中的检测效果

利用上述建立的6种植物激素同时检测方法，对马铃薯、油菜和苜蓿叶片中提取的内源激素进行检测(图3).3种植物叶片中6种内源激素尽管存在含量和灵敏度差异，以及提取液中其他化学组分的干扰，但是激素均有较好的出峰和分离度.这表明本研究所建立的同时检测6种植物激素的方法可用于植物激素的快速检测.

图1 GA3、iPAde、6-BA、IAA、SA和ABA标准品独立测定的LC(A)-MS(B)图谱Figure 1 Chromatograms of GA3,iPAde,6-BA,IAA,SA and ABA individually determined by LC(A)-MS(B)

图2 GA3、iPAde、6-BA、IAA、SA和ABA标准品同时测定的LC-MS图谱Figure 2 Chromatograms of GA3,iPAde,6-BA,IAA,SA and ABA simultaneously determined by LC-MS

表2 6种植物激素的线性关系和检出限

图3 LC-MS同时测定方法在植物内源激素检测中的应用Figure 3 Application of simultaneous determination by LC-MS in plant endogenous hormones

3 讨论

HPLC基于高压、高速、高效、高灵敏度和操作方便的特点，以及适宜于高沸点、热稳定性差和相对分子质量大的有机化合物，已广泛的应用于自然界有机化合物的分离与分析[11]，当然也包括同时分离测定植物多种内源和外源激素，比如张玉琼等[10]同时测定了小麦叶中5种激素(IAA、ABA、GA3、ZT和SA)，杨途熙等[12]同时测定了杏花芽中8种激素(ZT、GA3、IAA、6-BA、ABA、IBA、腺素和秋水仙素)，李华等[13]同时测定了枇杷果实中10种激素(ZT、GA3、SA、6-BA、IAA、IBA、JA、ABA、激动素和苯甲酸).尽管HPLC能借助色谱柱对有机化合物进行高效的分离，然而其对化合物的检测器主要为紫外光度检测器(ultraviolet photometric detector)、光电二极管陈列检测器(photo-diode array detector)、荧光检测器(fluorescence detector)、差示折光检测器(differential refractive index detector)和电导检测器(electrical conductivity detector)等光谱的检测方面，不能从化合物结构上进行真正鉴定，而生物提取液中含有大量的化学结构相似和极性相近的化合物.

MS分析可在电喷雾大气压(electron spray ionization,ESI)离子源的基础上使单体或混合物离子化，按照质荷比m/z (mass-charge ratio)进行分离，然后从分子离子峰可以准确地测定物质的相对分子质量，进而利用元素的精确质量及丰度比求算其元素组成，最终根据有机化合物的标准谱图检索，确立或者推测化合物的分子式[11].基于此，LC-MS联用不仅可以使得化合物在LC的条件下进行较好的分离和含量的检测，而且还可以在后续MS的条件下对分离的化合物进行结构的鉴定，最终实现对生物体内提取所得化合物的含量和种类进行同时检测.

本研究通过对LC-MS/MS测定过程中流动相、流速、柱温等的优化，最终建立了可针对不同植物，同时测定6种植物激素(GA3、iPAde、6-BA、IAA、SA和ABA)的高效与便捷检测方法，这将对深入研究植物生长与发育过程、揭示植物响应生物与非生物环境机制、提高植物产量和品质以及鉴定残留激素等方面具有重要的实际应用与参考价值.