CRISPR/Cas9介导下敲除KNDC1的人脐静脉内皮细胞具有抗衰老能力

孙靖玉，姚 赫，胡 刚，魏 洁，郭 君，张 鑫，林雅军

(北京医院 国家老年医学中心 国家卫生健康委员会老年医学重点实验室，北京 100730)

衰老(aging)是慢性疾病发展的主要危险因素，影响包括心血管系统、肌肉和骨骼在内的各种组织[1]。血管衰老是多种心血管病变的基础，如动脉粥样硬化斑块形成、心肌梗死、心力衰竭等[2]。由于动脉粥样硬化性心血管疾病是全世界死亡的主要原因[3]，而且内皮细胞衰老是血管疾病的一个关键危险因素[4]，因此,迫切需要研究预防内皮细胞衰老的方法。KNDC1[kinase non-catalytic C-lobe domain (KIND) containing 1]是一种Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子(RasGEF)，包含两个激酶非催化c-叶结构域(KIND)的串联重复序列，被认为与蛋白质-蛋白质相互作用有关[5]。前期研究发现过表达KNDC1能够促进HUVECs衰老[6]。但是敲除KNDC1是否能够延缓HUVECs衰老尚不明确。CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9是细菌和古细菌形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA[7]，其利用single向导RNA(single-guide RNA，sgRNA)介导的Cas9蛋白对基因组DNA特异性地切割[8]。因此本研究将利用CRISPR/Cas9技术敲除HUVECs的KNDC1，并观察敲除KNDC1后HUVECs的抗衰老能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)为本室从脐静脉中分离，用含10%胎牛血清、100 U青霉素、100 U链霉素、含表皮生长因子的ECM培养基(ScienCell公司) 在37 ℃、5% CO2孵箱(Thermo Fisher Scientificals公司)中传代培养。人宫颈癌细胞系HeLa(HeLa细胞)(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)用含10%胎牛血清、100 U青霉素、100 U链霉素的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2孵箱中传代培养。

1.1.2 载体和试剂：Guide-it CRISPR/Cas9 Systems质粒构建试剂盒、一步法RT-qPCR试剂盒(TaKaRa公司)。BCA 试剂盒、转染试剂jet PRIME、Trizol(Thermo Fisher Scientificals公司)；RIPA裂解液(北京索莱宝有限责任公司)；抗KNDC1抗体、2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针(Sigma-Aldrich公司)；抗β-actin抗体(Santa Cruz公司)；山羊抗兔的二抗(北京中杉金桥生物有限公司)；衰老相关β-半乳糖苷酶染色试剂盒(SA-β-gal)(碧云天生物技术有限公司)。

1.1.3 引物合成和测序：所有引物与寡核苷酸的合成及样品测序均由生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA打靶载体的构建:利用麻省理工大学张峰实验室提供的网络工具(http://crispr.mit.edu)设计KNDC1的sgRNA，在正义链模板的5′端添加 CCGG；反义链模板的5′端添加 AAAC，以便与线性CRISPR/Cas9质粒载体的黏性末端互补。根据KNDC1蛋白的结构域功能，分别设计了靶向KNDC1-Exon1/2/3的5个 sgRNAs(表1)，分别命名为KNDC1-sgRNA1、KNDC1-sgRNA2、KNDC1-sgRNA3、KNDC1-sgRNA4和KNDC1-sgRNA5。

sgRNA寡核苷酸单链退火形成双链：将合成的寡核苷酸用DEPC水进行重悬，使其终浓度为100 μmol/L。取上游链和下游链各1 μL，补加8 μL的退火缓冲液组成10 μL体系。按以下程序进行退火：95 ℃ 2 min，85 ℃降温至30 ℃，梯度为10 min，25 ℃保持。将退火后的寡核苷酸用退火缓冲液稀释至100 nmol/L。连接载体：线性化pGuide-it-ZsGreen1 载体质粒2 μL(7.5 ng/μL)，退火后sgRNA寡核苷酸双链或Guide-it 对照退火寡核苷酸双链1 μL(100 nmol/L)，补水至2 μL，加入5 μL DNA连接混合物[取于Guide-it CRISPR/Cas9 System (Green)]，16 ℃ 孵育30 min。连接产物转化DH5α感受态细胞，1 mL SOC培养液37 ℃水浴1 h；氨苄抗性平板筛选，37 ℃ 倒置培养过夜后挑取单克隆，按照质粒小提步骤提取质粒，送北京生工测序验证。

表1 靶向KNDC1-Exon1/2/3的sgRNA寡核苷酸序列Table 1 Oligo sequences of sgRNA targeting KNDC1-Exon1/2/3

1.2.2 在HeLa细胞中验证打靶载体的敲除效率:将HeLa细胞接种于60 mm细胞培养皿，24 h 后分别取上述构建好的打靶载体及对照载体用jet PRIME转染试剂转染 HeLa细胞，通过荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)观察重组质粒的转染效率。转染48 h后提取细胞RNA和总蛋白，试验步骤参照Trizol试剂说明书和哺乳动物细胞裂解试剂说明书。然后通过real-time PCR检测KNDC1的转录水平，通过免疫印迹法检测KNDC1蛋白的表达水平，以此来评估打靶载体的敲除效果。

1.2.3 在HUVECs中进行KNDC1敲除:将HUVECs接种于60 mm细胞培养皿，24 h 后分别转染经HeLa细胞验证的敲除效果好的KNDC1重组载体和对照重组载体，转染48 h后，提取细胞RNA和总蛋白，然后通过real-time PCR检测KNDC1的转录水平，通过免疫印迹法检测KNDC1蛋白的表达水平。

1.2.4 SA-β-gal染色检测细胞衰老:将HUVECs接种于6孔板，分别用KNDC1重组载体和对照重组载体转染HUVECs，换M199培养液继续培养3 d，然后按照SA-β-gal染色试剂盒说明书进行衰老检测。

1.2.5 MTT法检测细胞增殖能力:分别转染KNDC1重组载体和对照重组载体的HUVECs接种于96孔板，设复孔6个，通过MTT法每日检测细胞增殖情况，连续8 d。

1.2.6 细胞内活性氧水平的检测:转染细胞同1.2.5，然后根据制造商的说明用10 μmol/L 2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针在37 ℃下染色30 min。染色后，用PBS洗涤细胞，然后通过荧光倒置显微镜观察细胞内活性氧含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 用于人 KNDC1敲除的打靶载体的构建

合成的5个sgRNAs寡核苷酸序列及对照寡核苷酸序列与线性质粒pGuide-it-ZsGreen1 载体连接构建重组质粒，挑选氨苄抗性阳性克隆质粒送北京生工测序，测序结果正确的阳性质粒分 别 名 为 Cas9-KNDC1-sgRNA1、Cas9-KNDC1-sgRNA2、Cas9-KNDC1-sgRNA3、Cas9-KNDC1-sgRNA4、Cas9-KNDC1-sgRNA5及Cas9-KNDC1-Con(图1，2)。

2.2 筛选打靶效率高的重组质粒

重组质粒成功转入HeLa细胞，转染效率达85%(图3A)，重组质粒1、2、3、4和5转染的HeLa细胞KNDC1 mRNA水平较对照组显著降低(图3B)(P<0.05)；靶基因KNDC1在191和54 ku处蛋白表达水平也较对照组均有显著降低(图3C)；其中重组质粒Cas9-KNDC1-sgRNA4和Cas9-KNDC1-sgRNA5打靶效率更高(P<0.01)，所以后续实验选用重组质粒4和5进行研究。

图1 质粒构建示意图Fig 1 Construction schematic of plasmid

图2 阳性克隆测序结果Fig 2 Sequencing results of positive clones in Escherichia coli

A.transfection efficiency of recombinant plasmid (×100);B.expression of KNDC1 mRNA after transfection of different recombinant plasmids and control plasmid;C.expression of KNDC1 protein after transfection of different recombinant plasmids and control plasmid;*P<0.05 compared with control group;**P<0.01 compared with control group;0=Cas9-KNDC1-control;1=Cas9-KNDC1-sgRNA1;2=Cas9-KNDC1-sgRNA2;3=Cas9-KNDC1-sgRNA3;4=Cas9-KNDC1-sgRNA4;5=Cas9-KNDC1-sgRNA5图3 KNDC1在HeLa细胞中的转录和表达水平Fig 3 Transcription and expression levels of KNDC1 in HeLa n=3)

2.3 在HUVECs中对KNDC1进行敲除验证

上述重组质粒转染HUVECs，转染效率约为65%(图4A)，重组质粒4和5转染的HUVECs KNDC1 mRNA水平较对照组显著降低(图4B)(P<0.05)；靶基因KNDC1在191和54 ku处蛋白表达水平也较对照组均有显著降低(图4C)。

2.4 敲除KNDC1能够延缓HUVECs衰老、增强细胞增殖能力及降低其活性氧水平

与转染Cas9-KNDC1-Con质粒的HUVECs(衰老细胞百分率为64.0%)相比，转染Cas9-KNDC1-sgRNA4和Cas9-KNDC1-sgRNA5质粒的HUVECs衰老细胞数显著降低，分别为3.8%和4.5%(图5A),细胞增殖能力有明显增强(图5B)。与转染Cas9-KNDC1-Con质粒的HUVECs(活性氧染色阳性细胞百分率49.4%)相比，转染Cas9-KNDC1-sgRNA4和Cas9-KNDC1-sgRNA5质粒的HUVECs衰老活性氧水平也有显著降低，分别为3.8%和3.5%(图6)。

3 讨论

心血管系统的正常功能对于维持组织稳态和提高机体的最大寿命至关重要。血管内皮细胞衰老是动脉粥样硬化及其他年龄相关心血管疾病的基础[9-10]。KNDC1是2006年发现的基因，日本学者研究发现，其能负调控神经元树突的生长，这一功能与Ras鸟苷酸交换因子活性和蛋白丝/苏氨酸激酶活性相关[11-12]。前期研究发现，过表达KNDC1会使HUVECs衰老细胞数增加[6]，KNDC1 siRNA 处理内皮细胞后，细胞增殖能力增强[13]。但是在HUVECs中敲除KNDC1后，其抗衰老能力是否增强尚未见报道。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了5种人KNDC1敲除重组质粒。该技术是近年来新兴的，高效的基因编辑技术；是由sgRNA介导的Cas9核酸酶对靶基因进行编辑；其不会将外源基因整合到细胞基因组上，生物安全性较高[14-15]。经测序验证重组质粒序列正确后，分别将5种质粒转染到HeLa细胞，通过荧光显微镜观察发现转染效率高达85%。本研究首先选择HeLa细胞验证重组质粒的转染效率，是因为质粒容易转染进入HeLa细胞。接下来通过real-time PCR和Western blot进行检测，发现5种质粒均能显著降低KNDC1转录和表达水平(P<0.05)，其中重组质粒4和5敲除效率较高。因此本实验将在HUVECs中对质粒4和5进行研究。

A.transfection efficiency of recombinant plasmid (×100);B.expression of KNDC1 mRNA after transfection of different recombinant plasmids and control plasmid;C.expression of KNDC1 protein after transfection of different recombinant plasmids and control plasmid;*P<0.01 compared with control group;0=Cas9-KNDC1-control;4=Cas9-KNDC1-sgRNA4;5=Cas9-KNDC1-sgRNA5图4 KNDC1在HUVECs中的转录和表达水平Fig 4 Transcription and expression levels of KNDC1 in n=3)

将重组质粒4和5转染HUVECs后，通过荧光显微镜观察发现转染效率为65%，低于HeLa细胞中的转染效率，可能是由于质粒较难进入内皮细胞所致；通过real-time PCR和Western blot检测发现KNDC1转录和表达水平显著降低，但并未完全敲除，可能是由于小部分HUVECs没有重组质粒进入所致。后续研究将考虑构建KNDC1敲除腺病毒载体来增加敲除效率。此外通过SA-β-gal染色和MTT法实验证实，KNDC1敲除后内皮细胞衰老数显著减少、细胞增殖能力增强，DCFH-DA荧光探针染色结果显示，ROS水平显著降低。在后续实验中，将进一步研究KNDC1影响细胞衰老的信号通路，对其作用机制做进一步的探讨。

综上所述，本研究采用了CRISPR/Cas9技术成功构建出重组人KNDC1-Cas9敲除载体。构建的人KNDC1-Cas9敲除载体可用于HUVECs中KNDC1的敲除，将为研究KNDC1在细胞衰老方面的作用提供可靠的技术支持。