不同产地茯苓中7种三萜类成分含量的测定及聚类分析

2020-09-21万鸣黄超杨玉莹罗心遥叶晓川丁影董琼陈树和

中国药房 2020年17期

万鸣黄超杨玉莹罗心遥叶晓川丁影董琼陈树和

摘要目的：建立同时测定茯苓药材中7种三萜类成分含量的方法，并比較不同产地茯苓药材中上述成分的差异性，为茯苓药材的质量控制提供参考。方法：以不同产地的36批茯苓药材为样品，采用高效液相色谱法测定去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸的含量。色谱柱为Thermo Acclaim 120 C18，流动相为乙腈-磷酸水（梯度洗脱），流速为1 mL/min，检测波长为210 nm，柱温为30 ℃，进样量为20 μL。采用SPSS 21.0统计学软件对36批不同产地茯苓药材进行聚类分析。结果：7种三萜类成分在各自质量浓度范围内线性关系均良好（r均不低于0.999 0），平均加样回收率为96.74%～104.04%（RSD为0.54%～1.55%，n=6）;精密度、重复性、稳定性（24 h）试验的RSD均小于3.0%（n=6）;耐用性试验的RSD均小于5.0%（n=2）。不同产地样品之间7个指标成分的单一含量均存在一定差异，但总体差异不明显（多数样品总含量分布在1.3～1.9 mg/g之间）。经聚类分析，36批样品共聚为5类，即S27单独聚为第Ⅰ类，S30、S34聚为第Ⅱ类，S2、S8、S9聚为第Ⅲ类，S10、S11、S12、S14聚为第Ⅳ类，其余26批样品聚为第Ⅴ类。结论：该方法操作简单，精密度、重复性、耐用性均良好，可用于同时测定茯苓药材中上述7种三萜类成分的含量。各产地茯苓药材的质量总体差异不显著，大部分产区的茯苓含量均一、质量稳定，仅少部分存在差异。

关键词茯苓;三萜类成分;高效液相色谱法;含量测定;聚类分析

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the content determination of 7 kinds of triterpenoids in Poria cocos， and to compare the differences of the above components in P. cocos from different habitats， so as to provide reference for the quality control of P. cocos. METHODS： Using 36 batches of P. cocos from different habitats as samples， HPLC method was used for content determination of dehydrotomorphic acid， polyporhinic acid C， 3-epidehydrotomorphic acid， 3-O-acetyl-16α-hydroxy-hydrogenolysaccharic acid， dehydrotomorphic acid， pachymic acid and dehydrotrametenolic acid. The column was performed on Thermo Acclaim 120 C18 with mobile phase consisted of acetonitrile-phosphoric acid water （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 210 nm. The column temperature was 30 ℃， and the injection volume was 20 μL. SPSS 21.0 statistical software was used for cluster analysis of 36 batches of P. cocos from different habitats. RESULTS： The linearity of 7 triterpenoids was good in the range of their mass concentration （all r≥0.999 0）; average recoveries were 96.74%-104.04% （RSD=0.54%-1.55%， n=6）. RSDs of precision， and reproducibility stability （24 h） tests were all lower than 3.0% （n=6）. RSD of durability test was lower than 5.0% （n=2）. There were some differences in the single content of 7 indicator components among samples from different habitats， but the total content difference was not obvious （the total content of most samples was in the range of 1.3-1.9 mg/g）. After cluster analysis， 36 batches of sample were clustered into 5 categories， i.e. S27 was clustered into class Ⅰ; S30 and S34 were clustered into class Ⅱ; S2， S8 and S9 were clustered into class Ⅲ; S10， S11， S12 and S14 were clustered into class Ⅳ; and the remaining 26 batches of samples were clustered into class Ⅴ. CONCLUSIONS： The method is simple， and has good precision， repeatability and durability. It can be used for the simultaneous determination of above 7 components in P. cocos. There has no significant difference in the quality of P. cocos from different habitats. The content of P. cocos in most producing areas is uniform in content and stable in quality， only a few of them are different.

KEYWORDS Poria cocos; Triterpenoids; HPLC; Content determination; Cluster analysis

茯苓為多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos （Schw.）Wolf]的干燥菌核，始载于《神农本草经》，列为上品，其味甘、淡，性平，具有健脾补中、养心安神、利水渗湿的功效，主要用于水肿尿少、痰饮眩悸、脾虚食少、便溏泄泻、心神不安、惊悸失眠等症[1-2]。茯苓中主要有效成分为多糖类和三萜类[3]。在三萜类化合物中，去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸含量较高，且具有抗癌、利尿、神经伸展促进、免疫抑制、抗炎等药理活性[4-6]。

目前，茯苓中三萜类成分的含量测定方法有比色法和高效液相色谱（HPLC）法，但由于比色法的自身局限性，所以更多的是采用HPLC法进行测定。以往采用HPLC法进行多成分测定的研究中，一般是考虑茯苓中含量较高或易得的三萜类成分，最多的测了6种三萜类成分[7-11]。近期，田双双等[12]同时测定了茯苓中10种三萜类成分的含量，其中平均含量大于万分之一的仅有5种。本研究以不同产地（湖北、安徽、云南、贵州等）的茯苓为样品，采用 HPLC法同时测定其中含量大于万分之一且具有显著药理活性的7种三萜类化学成分（去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸）的含量，并比较不同产地茯苓药材中上述成分的差异性，为茯苓药材的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

U3000型HPLC仪[戴安（上海）分析仪器有限公司];Chromeleon色谱工作站、FA604C型万分之一分析天平（美国OHAUS公司）;DV215CD型十万分之一分析天平（瑞士Pricisa公司）;JP-04OST型超声提取机（昆山市超声仪器厂）。

1.2 药品与试剂

36批茯苓药材分别采自湖北、云南、安徽、贵州等地，经湖北省中医院/湖北省中医药研究院药事部陈树和主任药师鉴定均为多孔菌科真菌茯苓[P. cocos （Schw.） Wolf]的干燥菌核;去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸对照品均为本实验室自制（批号均为20191021），经峰面积归一化法计算得上述对照品的质量分数均大于98%;甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水。36批茯苓样品信息详见表1（注：表中“打引巴”为茯苓在覆土下窖栽培时加一块鲜菌核于段木上，起到了菌丝诱引生长作用，也称肉引栽培）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Acclaim 120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸水（B），梯度洗脱（0～7 min，65%A;7～25 min，68%A;25～27 min，70%A;27～45 min，76%A;45～56 min，80%A;56～62 min，100%A）;流速：1 mL/min，柱温：30 ℃;检测波长：210 nm;进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备精密称取一定量的去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸对照品，分别置于不同25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制备各单一对照品母液。分别取一定量的各对照品母液置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀释制成去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸质量浓度分别为0.040 4、0.040 6、0.029 7、0.014 6、0.020 4、0.126 8、0.019 4 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备精密称取茯苓细粉（过80目，下同）2 g，置于50 mL锥形瓶中，加入甲醇10 mL，称定质量，摇匀，超声（频率：40 kHz，功率：500 W）提取30 min，静置15 min后再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，以0.45 ?m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验取阴性对照溶液（即甲醇溶液）、混合对照品溶液、供试品溶液（样品编号：S26），分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，7种待测成分与各自相邻峰间的分离度均大于1.5，理论板数均大于10 000，色谱峰对称因子在0.95～1.05之间，且阴性对照无干扰，结果见图1。

2.3.2 线性关系考察精密吸取混合对照品溶液10、18、20、25、30、50 μL，分别按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标（y）、进样量为横坐标（x，?g）进行线性回归。结果表明，各成分在各自进样量范围内与其峰面积均呈良好的线性关系（r均不低于0.999 0）。7种三萜酸类成分的回归方程与线性范围测定结果见表2。

2.3.3 定量限与检测限考察分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，以甲醇倍比稀释后，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分别计算定量限、检测限。结果，去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸的定量限分别为0.282 8、0.284 2、0.237 6、0.102 2、0.142 8、0.152 2、0.116 4 μg，检测限分别为0.080 8、0.081 2、0.089 1、0.029 2、0.040 8、0.050 7、0.038 8 μg。

2.3.4 精密度试验取供试品溶液（样品编号：S26）适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，连续测定6次，记录峰面积。结果显示，去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸峰面积的RSD分别为1.60%、1.72%、0.42%、1.70%、1.64%、1.61%、1.52%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.5 重复性试验称取茯苓细粉（样品编号：S26）2 g，平行6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并以外标法计算各成分的含量。结果显示，去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸含量的RSD分别为0.72%、0.72%、1.29%、1.31%、0.97%、0.64%、0.56%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.3.6 稳定性试验取同一供试品溶液（样品编号：S26），分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸峰面积的RSD分别为1.81%、1.97%、1.93%、1.35%、2.03%、0.64%、0.62%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定。

2.3.7 加样回收率试验精密称取已知含量的茯苓细粉（样品编号：S26）1 g，平行6份，按与已知成分含量1 ∶ 1（m/m）的比例精密加入相应对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以外标法计算各成分的含量并计算加样回收率。结果显示，茯苓中7种待测成分的平均加样回收率为96.74%～104.04%，RSD为0.54%～1.55%（n=6），表明本方法准确度较好。加样回收率试验结果见表3。

2.3.8 耐用性考察在固定其他色谱条件不变的情况下，分别考察不同型号色谱柱[Thermo Acclaim 120 C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、Sepax GP-C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、Agela Innoval C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）]和不同柱温（30、35 ℃）对7种成分含量测定的影响。试验重复2次，取平均值。结果显示，在不同色谱柱或不同温度下测得的7种成分含量无明显差异，RSD均小于5.0%（n=2），表明本方法的耐用性较好。耐用性试验结果见表4。

2.4 样品含量测定

取36批不同产地茯苓药材粉末，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，然后按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，以外标法计算样品中7种成分的含量，结果见表5。

结果显示，36批茯苓样品中7种三萜类成分的总含量在0.887 7～2.519 0 mg/g之间，多数样品中总含量分布在1.3～1.9 mg/g范围内。若以7个成分总含量的平均值（1.740 1 mg/g）下浮20%计，含量为1.392 1 mg/g，共有31批样品满足要求，占样品量的86.1%;若以样品数的90%合格计，则总含量为1.304 3 mg/g，共有32个样品满足要求。以上结果说明，各产区茯苓中7种成分含量测定值相对集中，比较稳定，总体差异不明显。

2.5 聚类分析

将36批茯苓样品中7种三萜类成分的含量测定结果导入SPSS 21.0 软件中，采用聚类分析法结合平均欧氏距离（d）进行分析，生成36批不同产地茯苓中三萜类成分含量的聚类分析树状图，详见图2。以d=14划分，36批样品共聚为5类：样品S27单独聚为第Ⅰ类，来自湖北英山;样品S30、S34聚为第Ⅱ类，分别来自湖北英山（代料栽培品）和云南普洱;样品S2、S8、S9聚为第Ⅲ类，分别来自云南永仁县孟虎乡（S2）、贵州凯里市碧浪镇（S8、S9）;样品S10、S11、S12、S14聚为第Ⅳ类，分别来自云南永仁县孟虎乡（S10）、贵州铜仁市德江县（S11、S12）、安徽安庆市岳西县（S14）;其余26批样品聚为第Ⅴ类，均来自湖北、云南广西等多个产地。其中，第Ⅰ类样品中各个成分的含量均相对较高，第Ⅰ～Ⅲ类样品中7种成分总含量均大于2.00 mg/g，第Ⅳ类样品中各成分含量均较低，第Ⅴ类样品中总含量在1.47～2.18 mg/g之间。由此可知，仅湖北、云南、贵州地区部分茯苓药材中7种成分含量相对较高，且26批来自湖北、云南、广西、安徽等地的样品均聚为一大类，表明大部分产区产出的茯苓药材含量均一、质量稳定，仅少量存在差异。

3 讨论

3.1 供试品提取时间和色谱条件的筛选

在前期研究中，本课题组考察了供试品超声提取时间（15、20、30、40 min）对提取效果的影响。结果显示，以甲醇为提取溶剂超声提取30 min后，样品中7种三萜类成分的含量最高。在波长的选择上，本课题组根据7种待测成分的吸收波长特点[13-14]，分别考察了在210、240 nm波长下的检测效果。结果发现，在210 nm波长下7种三萜类成分均有最大吸收，在240 nm波长下茯苓酸无吸收，故最终选择210 nm为测定波长。在流动相选择上，本课题组分别考察了乙腈-磷酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液的分离效果。结果发现，以乙腈-0.05%磷酸水溶液为流动相时，各待测成分与相邻峰之间分离度好，峰形尖銳、对称性好，理论板数均大于10 000，符合含量测定的分离要求。

3.2 不同产地茯苓中7种三萜类成分含量的差异分析

不同产地36批茯苓药材中7种三萜类成分含量测定的直观分析结果显示，大多数茯苓样品含量较均一，无明显地域上的差异，这可能是由于茯苓作为菌类药材不同于植物药材，其对不同土壤、气候等自然条件有着较强的耐受性。聚类分结果显示，除少数湖北、云南及贵州产样品中7种成分总含量较高之外，其余有26批样品均聚为一大类，以湖北、安徽大别山、云南等地为主要类别，产区之间的差异亦不明显。根据调查及现有的报道，目前茯苓栽培产区分布比较广，虽各产区的土壤、海拔、气候、种植加工方式等有一定差异，但茯苓作为菌类药材体现了其良好的生长适应性，质量相对稳定[15-19]。本研究结果亦表明，主产区茯苓药材样品间7种三萜类成分含量差异不明显，品质均一，提示在一定程度上可扩大临床使用茯苓的供应产区范围，这为解决药材供需矛盾起到了积极作用。

综上所述，本研究建立了HPLC 法同时测定茯苓药材中7种三萜类成分的含量，该方法操作简单，精密度、重复性和耐用性均良好，适用于茯苓药材的多成分定量分析。本次对36批不同产地样品进行含量测定及分析发现，以湖北、云南、贵州地区产部分茯苓的含量相对较高，但不同产地间样品差异不显著、质量较稳定。后期有必要继续扩大样本量，以全面掌握茯苓药材的品质。

参考文献

[ 1 ] 张年，李兆星，李娟，等.茯苓的化学成分与生物活性研究进展[J].世界科学技术：中医药现代化，2019，21（2）：220-233.

[ 2 ] 张越，程玥，刘洁，等.不同生长环境下茯苓总三萜和水溶性总多糖含量比较[J].安徽中医药大学学报，2019，38（4）：81-84.

[ 3 ] 文跃强，彭腾，贾波，等.茯苓有效成分的药理学研究概况[J].新疆中医药，2007，25（增刊）：173-175.

[ 4 ] 邓桃妹，彭代银，俞年军，等.茯苓化学成分和药理作用研究进展及质量标志物的预测分析[J].中草药，2020，51（10）：2703-2717.

[ 5 ] 李桂芹，吴晓锋，唐万侠，等.茯苓化学成分及生理活性研究[J].齐齐哈尔大学学报，2015，31（4）：50-54.

[ 6 ] XU H，WANG Y，JURUTKA PW，et al. 16α-hydroxytrametenolic acid from Poria cocos improves intestinal barrier function through the glucocorticoid receptor media- ted PI3K/Akt/NF-κB pathway[J]. J Agric Food Chem，2019，67（39）：10871-10879.

[ 7 ] 车爽，李清，霍艳双，等.波长转换RP-HPLC法同时测定茯苓不同部位中5种三萜酸含量[J].药学学报，2010，45 （4）：494-497.

[ 8 ] 沈玉萍，杨欢，陈斌，等.反相高效液相色谱法测定中药茯苓中4种三萜酸的含量[J].中国药学杂志，2011，46（5）：388-390.

[ 9 ] 张靓琦，贾英，罗洁，等.超高效液相色谱法同时测定茯苓中去氢土莫酸等6种活性成分的含量[J].中国药学杂志，2012，47（13）：1081-1083.

[10] 董远文.茯苓中三萜的分离纯化及含量测定研究[D].武汉：湖北中医药大学，2014.

[11] 彭灿，余生兰，张静，等. HPLC同时测定茯苓中4 种三萜酸的含量[J].中药材，2017，40（7）：1643-1646.

[12] 田双双，刘晓谦，冯伟红，等.基于特征图谱和多成分含量测定的茯苓质量评价研究[J].中国中药杂志，2019，47（9）：1371-1380.

[13] 韩小娟，罗建光，陆园园，等. HPLC-DAD-ESI-MSn法鉴定茯苓中的三萜成分[J].药学与临床研究，2009，17（4）：290-293.

[14] 刘校妃，李健康，唐怡，等.茯苓中去氢土莫酸和茯苓酸含量的高效液相色谱波长切换法同时测定[J].时珍国医国药，2016，27（3）：516-518.

[15] 王坤凤.茯苓化学成分及质量控制方法研究[D].北京：北京中医药大学，2014.

[16] 昝俊峰.茯苓三萜类成分抗肿瘤活性研究与茯苓药材质量分析[D].武汉：湖北中医药大学，2012.

[17] 於小波，昝俊峰，王金波，等.我國茯苓药材主要产区资源调查[J].时珍国医国药，2011，22（3）：714-716.

[18] 田玉桥，尹火青，陈三春，等.不同生长期采收的茯苓品质比较研究[J].食品研究与开发，2019，40（5）：12-16.