Sprouty1、2、4在寻常型银屑病患者皮损组织中的表达及临床意义

李锦意 张婷 柳莉丹 陈永锋

南方医科大学皮肤病医院皮肤科，广州510000

Sprouty 蛋白是1998 年Hacohen 等发现的Ras/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen⁃activated protein kinase，MAPK）信号通路特异性抑制蛋白［1］。各阶段胚胎和成人组织广泛表达Sprouty1、2 和4。Sprouty 蛋白可以拮抗受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）信号通路，发挥不同的功能，包括抑制人类胚胎干细胞增殖、转移及分化。国内外研究显示，Sprouty 参与多种肿瘤的增殖、分化及转移，其中Sprouty1 在多种类型的肿瘤中表达下调，包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌和肺癌，尤其是上皮间充质转移相关的肿瘤［2⁃3］。而Song 等［4］用多变量分析表明Sprouty2 的表达下调与肝癌高度恶性表型如血管侵袭和晚期肿瘤分期相关。寻常型银屑病是一种慢性炎症性红斑鳞屑性皮肤病，易复发，与角质形成细胞增殖分化密切相关。而参与银屑病发病机制的MAPK激酶控制着各种重要功能，如细胞增殖、分化、基因表达和角质形成细胞凋亡［5⁃6］。我们检测寻常型银屑病患者中Sprouty蛋白质和mRNA 的表达水平，探讨Sprouty 在寻常型银屑病患者皮损组织中的表达与银屑病面积和严重程度指数（PASI）评分的相关性和临床意义。

对象与方法

一、对象

2018 年5-11 月选择南方医科大学皮肤病医院皮肤科门诊就诊的寻常型银屑病患者15 例，以我院整形外科行整形手术者10 例为健康对照。所有患者取材前1 个月内未接受过系统治疗，2 周内未外用银屑病治疗药物，排除患有红斑狼疮、天疱疮、皮肌炎等自身免疫性皮肤病、严重感染和合并肝肾及其他严重疾病的患者以及怀孕、哺乳期妇女。健康对照组均排除银屑病和其他自身免疫性皮肤病，并经组织病理学证实取材皮肤正常。本研究已经过南方医科大学伦理委员会批准（批号GDDHLS⁃20180309），所有受试者均签署知情同意书。

二、主要试剂

二氨基联苯胺（DAB）为上海基因科技有限公司产品；兔抗人Sprouty1、2、4 多克隆抗体、内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）均为英国Abcam 公司产品；逆转录PCR（RT⁃PCR）试剂盒为日本Takara公司产品；二喹啉甲酸蛋白测定试剂盒为北京康为世纪公司产品；超敏型电化发光（ECL）底物为广东铂西生物科技有限公司产品。

三、实验方法

1.标本处理：选取寻常型银屑病患者躯干或四肢皮损及健康对照正常皮肤组织，各切取约1.5 cm×1.0 cm×0.5 cm 组织，平均分成3 份，其中2 份分别放入标记好的冻存管中，-80 ℃液氮冻存，用于Western 印迹和RT⁃PCR 检测；1 份用4%甲醇固定，常规石蜡包埋，用于免疫组化检测。

2. 免疫组化检测Sprouty 蛋白表达：石蜡标本切片脱蜡水化；加入烘箱脱膜液及95%乙醇高温脱蜡，流动水中冷却；滴入3%H2O2溶液室温避光孵育10 min，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次；分别滴加抗Sprouty1（1∶100）、2（1∶400）和4（1∶500）抗体，37 ℃孵育30 min，PBS 冲洗3 次。滴加羊抗兔多克隆抗体，37 ℃水浴20 min，PBS 冲洗3 次。DAB 显色，苏木精复染，95%乙醇置换去水。中性树胶封片，镜检，拍照。光镜下观察，细胞内见棕黄色颗粒即Sprouty 阳性，细胞着色强度高于背景为非特异性染色。

3.RT⁃PCR检测寻常型银屑病皮损和对照组皮肤中Sprouty mRNA 表达：将冻存组织研磨后用Trizol⁃A 一步法提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA 浓度和纯度。本实验选用两管反应体系对目的基因和内参照进行扩增，建立总体积为20 μl 的逆转录反应体系。逆转录完成后，取2 μl cDNA 进行PCR 扩增。扩增条件：94 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，60 ℃延伸1 min，共进行50个循环，循环结束后60 ℃延伸10 min，4 ℃保存。引物序列：GADPH 正向5′-AAGTATGACAACAGCCT CAAG-3′，反向3′-TCCACGATACCAAAGTTGTC-5′；Sprouty1 正 向5′-ATGGATCCCCAAAATCAAC A-3′，反向3′-CGAGGAGCAGGTCTTTTCAC-5′；Sprouty2 正向5′-CCCCTCTGTCCAGATCCATA-3′，反向3′-CCCAAATCTTCCTTGCTCAG-5′；Sprouty4正 向5′-CCCGGCTTCAGGATTTAC-3′，反 向3′-GCTGGACCATGACTGAGTTG-5′。RT⁃PCR反应结束后，LightCycler II DNA扩增仪自动分析并计算Ct值，以2-ΔΔCt为该目的基因mRNA 的相对表达量，2-ΔΔCt>1表示目的基因表达上调，反之下调。

4.Western印迹法检测银屑病皮损和正常对照皮肤Sprouty的表达：切除多余脂肪组织，保留表皮和真皮组织，提取皮损和正常皮肤组织蛋白，用二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，经10%十二烷基硫酸铵-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至聚偏氟乙烯膜上。将聚偏氟乙烯膜浸入5%牛血清白蛋白封闭液，于室温置摇床平缓摇动1 h；加入抗Sprouty1（1∶1 000）、Sprouty2（1∶1 000）和Sprouty 4（1∶1 000）抗体4 ℃孵育过夜，再加入羊抗兔多克隆抗体室温置摇床平缓摇动1 h，回收一抗和二抗后均用Tris⁃Buffered Saline and Tween 20（TBST）漂洗3 次，每次5 min。化学发光，曝光，显影，定影，凝胶成像系统拍照，用Gel⁃analyzer 分析系统对目的显色条带进行吸光度（A值）分析和扫描，观察各实验组目的蛋白条带灰度，以内参GADPH 蛋白条带灰度作为参照，以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值比值作为目的蛋白相对表达水平。

四、统计学处理

采用SPSS17.0 软件对数据进行统计处理。计量资料以±s 表示，两组间比较采用两独立样本t 检验。Sprouty 蛋白表达强度与PASI 评分的相关性采用Pearson相关分析。检验水准ɑ=0.05。

结 果

一、免疫组化检测结果

见图1。Sprouty1在对照组表皮全层细胞的细胞膜和细胞质中表达，呈深棕色，在颗粒层强表达，在银屑病皮损颗粒层细胞的细胞膜有少量表达，呈浅棕色。Sprouty4 在银屑病皮损棘细胞层的细胞核膜和核仁中表达，而在对照组棘细胞层整个细胞核中表达，均呈深棕色。Sprouty2 在两组棘细胞层的细胞膜上少量表达，呈淡黄色。

二、RT⁃PCR检测结果

见表1。银屑病皮损Sprouty1 mRNA表达强度低于对照组（P＜0.05），而Sprouty4 mRNA表达强度高于对照组（P＜0.05），Sprouty2 mRNA 表达在两组间差异无统计学意义（P>0.05）。

三、Western印迹法检测结果

Western 印迹法检测显示，银屑病皮损和正常对照皮肤中均有Sprouty1、2 和4 的表达，但银屑病皮损Sprouty1 蛋白表达量低于对照组（P＜0.001），而Sprouty4 蛋白表达量高于对照组（P＜0.001），Sprouty2 蛋白表达两组间差异无统计学意义（P =0.201）。见表1、图2。

图1 免疫组化检测Sprouty1、Sprouty4 和Sprouty2 的表达（×100） 1A、1B：Sprouty1在正常皮肤全层表达，在银屑病皮损颗粒层弱表达；1C、1D：Sprouty4 在正常皮肤及银屑病皮损中全层表达；1E、1F：Sprouty2 在正常皮肤及银屑病皮损中少量表达于棘层中下部

四、银屑病皮损Sprouty 蛋白表达量与PASI 评分的相关性

Pearson 相关分析显示，15 例寻常型银屑病患者PASI 评分与Sprouty1 蛋白相对表达量呈负相关（r =-0.628，P = 0.012），与Sprouty4 蛋白呈正相关（r=0.812，P ＜0.001），与Sprouty2蛋白无统计学相关性（r=0.436，P=0.104）。见图3。

讨 论

RTK 信号由RAS⁃RAF⁃MEK⁃MAPK 级联反应和PI3K⁃AKT 通路调节，这两个通路由负反馈环路调节。MAPK信号通路是细胞内增殖、分化中至关重要的信号通路。Tseng等［7］研究表明，MAPK被激活后通过与血管内皮生长因子相互作用促进血管形成，在表皮中促进细胞生长、增殖并调节免疫应答，从而参与银屑病的发病过程。也有研究显示，CKLF1⁃C19 多肽通过抑制MAPK 途径抑制炎症细胞浸润和微血管细胞增殖，从而阻止银屑病的进展［8］。Sprouty 蛋白的表达异常可能表明RTK/Ras/Raf/MAPK 信号的异常活化［9］。Sprouty蛋白和关键的负调控因子限制RTK 活化的强度和持续时间，阻碍RAS⁃RAF⁃MEK⁃MAPK 和PI3K⁃AKT 信号通路活化［10］。

本研究免疫组化显示，Sprouty1 在正常皮肤颗粒层胞膜和胞质高表达，而在寻常型银屑病皮损的颗 粒 层 胞 膜 弱 表 达，与Wang 等［11］研 究 发 现Sprouty1 主要位于正常皮肤的颗粒层角质形成细胞胞质中的结果一致。我们通过RT⁃PCR 和Western印迹检测发现，Sprouty1在寻常型银屑病皮损表达减少，而Wang 等发现Sprouty1 可能通过调节细胞周期相关蛋白来抑制增殖并促进细胞凋亡，且Sprouty1 可能在表皮终末分化中起作用，提示Sprouty1 可能参与角质形成细胞的分化。Sprouty1可能是正常皮肤表皮角质形成细胞和皮肤炎症反应中的负反馈调节剂，增强Sprouty1表达可能具有增强抗炎作用的可能性，从而可能抑制银屑病发病。但Sprouty1 参与银屑病的明确机制仍需进一步研究。

Sprouty4 在本文对照组皮肤和寻常型银屑病组皮损表皮细胞胞核均高表达，RT⁃PCR和Western印迹检测显示，寻常型银屑病组Sprouty4 mRNA 和蛋白表达增多。Shi 等［12］研究发现，Sprouty4 介导MAPK通路的蛋白质复合物磷酸化和去磷酸化，参与多种生物学功能，包括蛋白质转运、细胞间连接、转录控制、细胞迁移和信号通路调节。Xu 等［13］发现，Sprouty4 通过结合相关蛋白调节FGFR⁃RAS 途径来抑制ERK 磷酸化。Sprouty4 或许通过参与MAPK 通路相关蛋白磷酸化或去磷酸化参与细胞的转录、蛋白质转运等，从而参与银屑病的发生发展。但具体机制以及更多可能相关的信号通路仍需进一步研究。而Sprouty4 与Spouty1 在角质形成细胞分布不同，可能二者作用于不同阶段角质形成细胞，从而相辅相成促进银屑病的发生发展。相关性分析显示，Sprouty1 与PASI 评分呈负相关，而Sprouty4 则呈正相关，进一步支持Sprouty1、Sprouty4与银屑病密切相关的观点。

表1 寻常型银屑病组皮损和对照组正常皮肤Sprouty mRNA和蛋白的表达水平（±s）

表1 寻常型银屑病组皮损和对照组正常皮肤Sprouty mRNA和蛋白的表达水平（±s）

注：a 以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值比值作为目的蛋白相对表达水平

组别例数mRNA表达（2-ΔΔCt）蛋白表达a Sprouty1 0.972±0.105 0.844±0.169 2.143 0.043 Sprouty2 1.005±0.012 0.097±0.091-0.648 0.523 Sprouty4 0.714±0.615 1.727±1.017 2.814 0.010 Sprouty1 0.413±0.108 0.148±0.141-5.015<0.001对照组银屑病组t值P值10 15 Sprouty2 0.148±0.141 0.292±0.154-1.316 0.201 Sprouty4 0.584±0.304 1.306±0.283 6.063<0.001

图2 Western印迹检测Sprouty1、Sprouty4和Sprouty2的表达 与对照组相比，Sprouty1在寻常型银屑病皮损中表达减少，Sprouty4表达增多，Sprouty2表达无明显差异。GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

图3 15例寻常型银屑病患者Sprouty1（4A）、Sprouty4（4B）、Sprouty 2（4C）蛋白表达与银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）评分相关性

免疫组化、RT-PCR 和Western 印迹检测显示，Sprouty2 mRNA和蛋白在健康对照组和寻常型银屑病组之间差异无统计学意义，提示Sprouty2可能与银屑病发病发展无相关性。由于大量研究提示，Sprouty2 与肿瘤相关，Sprouty2 与银屑病的关系仍需进一步研究。

综上所述，在寻常型银屑病患者皮损中Sprouty1表达下调，而Sprouty4表达上调，且二者均与PASI 评分存在相关性，提示Sprouty1 和Sprouty4在寻常型银屑病的发生发展过程可能发挥重要作用，为进一步阐明银屑病发病机制及临床治疗提供新思路。但Sprouty1和Sprouty4如何通过相关蛋白或通路参与银屑病的发生发展，仍需深入研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突