氨基纳米磁珠粒径大小影响因素研究

纪 欣，白 静，艾 静，于加平

(吉林农业科技学院，吉林 吉林 132101)

复合纳米磁珠是一种高通量的材料，可以快速提取生物中的核酸样本。随着分子生物学的快速发展，核酸提取需要解决的关键问题也变成了用简单、快速、适合大众的方法从多种生物组织中来获得高产量和高品质的基因组DNA[1]。纳米磁珠就是指具有纳米的超顺磁微球，是一种新型的纳米材料。使用这种材料提取DNA与传统的分离方法相比，能将DNA从复杂的生物样品中快速分离出来，能够实现分离和富集的同时进行，有效地提高了分离速度和富集效率[2]，同时也使分析检测的灵敏度大大提升。

1 试剂和仪器

1.1 试剂

二价铁盐、三价铁盐、氨丙基三乙氧基硅烷、十一烯酸、十二烷基硫酸钠、四乙氧基硅烷、盐酸、氨水、油酸(均为北京化学试剂厂生产，纯度为分析纯)。

1.2 仪器

透射电子显微镜(JEM-2100UHR型，日本JE-OL公司生产)，红外光谱仪(Avatar-360型，美国尼高力公司生产)，电子天平(JA2002，上海精天电子仪器有限公司生产)，烘干箱(DZF-6020型，上海精宏实验设备有限公司生产)，超声波清洗仪(KL-040型，深圳市科力超声波洗净设备有限公司生产)，水浴摇床(YXQ.SG41.280，海生银医疗仪器仪表厂生产)。

2 试验方法

2.1 氨基纳米磁珠的制备

量取100 mL水于500 mL三口瓶中，继续进行超声溶解10 min。通入N2，加入3.80 g FeCl2·4H2O，溶解后再超声超10 min[3]。迅速加入9 mL氨水并伴随剧烈的搅拌，观察到有Fe3O4粒子生成后开始缓慢加入油酸15 mL，在70℃的温度下，剧烈搅拌1 h。所得产物备依次用水和丙酮洗涤多次，直至清洗看到磁性纳米颗粒。将所得产物进行干燥备用。将干燥后的磁流体粉末称取0.74 g，溶于6 mL石油醚[4]中，将其所得的产物进行超声10 min左右，使其均匀分散。在24 mL水中使用移液器量取550μL十一烯酸加入，使用NaOH溶液调节pH至8.0。亲水性磁流体的制备：取反应后的磁性颗粒溶液4 mL，逐滴加入到十一烯酸钠溶液中，进行1 h的剧烈搅拌即可得到。取一定量的过硫酸钾、所制备的水溶性磁流体及450 μL石油醚放置于单口瓶中，通N2排尽瓶内空气后进行密封。将单口瓶置于水浴摇床中70℃加热24 h。制备的磁性微球分别用水和乙醇洗涤2～3次，分散于乙醇溶液中备用。取1 g磁性微球加入100 mL 80%的乙醇水溶液中，将其分散均匀。依次加入0.4 mL氨水和0.25 mL四乙氧基硅烷，室温超声3 h。产物依次用无水乙醇和蒸馏水进行洗涤，洗涤完成后进行干燥，即得表面硅羟基包覆的磁性微球。取1 g表面硅羟基修饰的磁性微球分散于100 mL 80%的乙醇水溶液中，加入0.4 mL氨水和0.25 mLγ-氨丙基三乙氧基硅烷，室温超声3 h。所得产物用无水乙醇和蒸馏水洗涤，干燥后即得表面氨基包覆的磁性微球[5]。

2.2 过硫酸钾的量对纳米磁珠粒径大小的影响

在2.1试验方法基础上，固定温度为70℃、加入0.25 mL四乙氧基硅烷的条件下，分别称取0.010 00 g、0.015 00 g、0.020 00 g过硫酸钾的量，制备复合氨基纳米磁珠。

2.3 四乙氧基硅烷的量对纳米磁珠粒径大小的影响

在2.1方法基础上，固定在温度为70℃、加入0.015 00 g过硫酸钾的条件下，分别加入0.15 mL、0.25 mL、0.35 mL的四氧基硅烷，制备复合氨基纳米磁珠。

2.4 温度的变化对纳米磁珠粒径大小的影响

在2.1方法基础上，固定加入0.25 mL四乙氧基硅烷、0.015 00 g过硫酸钾的条件下，改变水浴摇床的温度为80℃、70℃、60℃，制备复合氨基纳米磁珠。

3 结果与分析

3.1 氨基纳米磁珠制备的结果

取1 g制备完成的氨基纳米磁珠，将其在无水乙醇溶液中进行分散，加入适量的茚三酮，密封后进行加热，可以观察到三角瓶中的溶液由黄色逐渐变为紫色，即证明所制备磁性微球上含有氨基。

3.2 运用电镜对制备的纳米磁珠进行表征

3.2.1 过硫酸钾的量对纳米磁珠粒径大小的影响

按2.2方法制得氨基纳米磁珠，经电镜扫描，结果如图1所示。图1A1、A2、A3分别为0.010 00 g、0.015 00 g、0.020 00 g 过硫酸钾所制备的氨基纳米磁珠。由图可知，含量为0.015 00 g 的过硫酸钾所修饰的纳米磁珠粒径大小均一，分散性较好，因此本试验加入0.015 00 g 的过硫酸钾为宜。

3.2.2 四乙氧基硅烷的量对纳米磁珠粒径大小的影响

按2.3方法制得氨基纳米磁珠，经电镜扫描，结果如图2所示。图2B1、B2、B3分别为0.15 mL、0.25 mL、0.35 mL四乙氧基硅烷所制备的氨基纳米磁珠。由图可知，0.25 mL四乙氧基硅烷所修饰的纳米磁珠粒径大小均一，均为400 nm左右，从而使用0.25 mL四乙氧基硅烷对纳米磁珠进行修饰可以保证纳米粒子的高吸附量，并减小修饰对磁性纳米颗粒的影响，故应当加入0.25 mL四乙氧基硅烷。

3.2.3 温度的变化对纳米磁珠粒径大小的影响

按2.4方法制得氨基纳米磁珠，经电镜扫描，结果如图3所示。图3C1、C2、C3分别为80℃时、70℃时、60℃时所制备的氨基纳米磁珠。由图可知，当温度为70℃时，所制备的纳米磁珠粒径均匀，粒径大小普遍为400 nm，分布较均匀，故本研究认为应采用70℃为宜。

图1 不同量过硫酸钾制备氨基纳米磁珠的电镜扫描图Fig.1 Scanning electron microscope of amidogen nanometer beads prepared by different volume of potassium persulfate

图2 不同量四乙氧基硅烷制备氨基纳米磁珠的电镜扫描图Fig.2 Scanning electron microscope of amidogen nanometer beads prepared by tetraethoxy-silicanen of different volumes

图3 不同温度制备氨基纳米磁珠的电镜扫描图Fig.3 Scanning electron microscope of amidogen nanometer beads prepared under different temperatures

3.3 利用红外光谱对制备的纳米磁珠进行表征

通过TEM可得在70℃，加入0.015 00 g过硫酸钾、0.25 mL四乙氧基硅烷的氨基纳米磁珠为最佳，使用此试剂含量的条件下将所制得的磁性纳米颗粒通过磁分离和超声分散的方式，分别使用去离子水和无水乙醇进行3次以上的清洗，一直到红外光谱仪检测无有机物被洗出之后，所得的磁性微球粉末干燥后进行KBr压片制样，然后使用红外光谱仪测定磁性微粒的红外光图谱。如图4所示。图4为氨基纳米磁珠的红外图谱，在548 cm-1处有一强吸收峰，对应Fe3O4的Fe-O特征伸缩吸收峰，图中峰形完整，说明了磁性纳米颗粒成功结合。811 cm-1和1 387 nm-1分别为Si-O-Si的对称和不对称伸缩振动吸收峰，1 289 cm-1处为Si-O-Si的弯曲振动峰，说明四乙氧基硅烷修饰成功。2 932 cm-1处为C-H对称振动峰，2 331 cm-1处为N-H键变形振动峰，说明氨基纳米磁珠制备成功。

图4 红外光图谱Fig.4 Infrared spectrum

4 结论

以Fe3O4纳米材料为磁性核，以共沉淀法研制的复合纳米磁珠，再以三价铁盐和二价铁盐为原料在碱性条件下制备Fe3O4纳米材料，经电镜表征和红外表征确定过硫酸钾的量为0.015 00 g、四乙氧化硅烷0.25 mL、水浴加热70℃所制得的氨基纳米磁珠粒径大小均匀，利用所得到的纳米磁珠对DNA进行提取，所提取的DNA的纯度较高，所制备的复合纳米磁珠性能比较稳定。

氨基纳米磁珠为分子生物学、细胞生物学、蛋白质学的研究提供一种高性能的分离纯化材料，进而为其发展提供强有力的理论基础。可为新型的生物提取分离手段提供所需高效材料的研发奠定理论基础和数据支持。制备新型、高性能、稳定的多种物质包埋式纳米磁珠为生命科学、食品科学、医学等方面的研究提供一种高效的材料。