蒙脱石和枯草芽孢杆菌对蛋鸡血浆生化指标、小肠刷状缘酶活性及黏蛋白表达的影响

2020-09-18陈继发曲湘勇

中国畜牧杂志 2020年9期

陈继发，曲湘勇

（1.宜春学院生命科学与资源环境学院，江西宜春 336000；2.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙 410128）

肠道碱性磷酸酶（ALP）和二糖酶存在于小肠黏膜上皮细胞刷状缘内，其活性是评价肠上皮细胞发育和肠道功能的重要指标[1]。黏蛋白是肠黏膜免疫系统中第一道防线——黏液层的主要成分，对肠黏膜屏障的完整性和免疫功能具有调节作用[2]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，BS）是一种应用广泛的饲用益生菌，BS 能提高乳鸽小肠二糖酶和ALP 活性[3]，上调肉仔鸡空肠黏蛋白2（mucin-2）mRNA 表达量[4]，提示其能改善动物肠道屏障，但关于BS 对蛋鸡小肠刷状缘酶活性和黏蛋白分泌影响的研究鲜有报道。蒙脱石（Smectite，SM）是一种层状硅铝酸盐类黏土，可在肠道内吸附有害菌、细菌毒素和霉菌毒素等，改善动物肠道健康[5]。研究指出，SM 可提高断奶仔猪空肠二糖酶活性[6]，有增加小肠杯状细胞数量的趋势[7]，但SM 是否能提高蛋鸡肠道刷状缘酶活性和黏蛋白表达尚不得知。体外试验表明，BS 和SM 在抑制有害菌、改善肠道屏障方面有协同作用[8]，推测二者联用或许有利于维护蛋鸡肠道屏障。课题组前期研究发现，添加5×108CFU/kg BS、0.5 g/kg SM 及二者联用均提高了蛋鸡产蛋性能[9]，推测与蛋鸡机体养分代谢、肠道健康有一定关联。因此，本试验旨在探讨BS、SM 及其联用对蛋鸡血浆生化指标、小肠刷状缘酶活性和黏蛋白表达的影响，以期为二者在蛋鸡生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 BS（可速必宁）购买于上海牧冠企业发展有限公司，BS 活菌数≥1×109CFU/g。SM（加利百灵-Z）由美国安牧然国际公司提供，其主要成分为钙基SM>70%，无定形水合二氧化硅>15%。

1.2 试验设计与饲养管理本试验采用2×2 双因子随机设计，选择29 周龄健康的罗曼粉壳蛋鸡360 只，随机分为4 个处理组，每个处理组6个重复，每个重复15 只。对照组蛋鸡饲喂基础饲粮，试验组蛋鸡分别饲喂在基础饲粮中添加5×108CFU/kg BS、0.5 g/kg SM、5×108CFU/kg BS+0.5 g/kg SM 的试验饲粮。预试期1 周，正试期10周。预试期各处理组蛋鸡均饲喂基础饲粮，每日认真观察鸡群，并进行适当调整，使各处理组间蛋鸡的采食量、蛋重和产蛋率差异不显著。试验基础饲粮参考《鸡饲养标准》（NY/T 33-2004），并综合考虑生产实际配制，基础饲粮组成及营养成分见表1。

表1 基础饲粮组成及营养成分（风干基础）

蛋鸡为3 层阶梯式笼养，每笼饲养3 只，各处理组的试验鸡均匀分布在鸡舍的上、中、下层。每日喂料2次（08:00 和15:00），上午、下午各捡蛋1 次。各组蛋鸡饲养管理条件相同，正试期鸡舍内平均温度、相对湿度分别为（25.55±2.78）℃、（77.23±6.25）%。蛋鸡自由饮水，采用人工光照与自然光照相结合的光照方案，蛋鸡每日光照时间为16 h。鸡舍的卫生清扫、消毒及粪便清理等常规工作按照鸡场管理程序进行。

1.3 样品采集试验结束后，每个处理组随机选择12 只蛋鸡（每个重复2 只）进行采血，采血前12 h 停止喂料、自由饮水。参照文献[9]的方法采集蛋鸡血液和制备血浆，将血浆样品保存于-20℃。另外，从每组随机选取6 只鸡（每个重复1 只），参照文献[9]的方法采集蛋鸡十二指肠和空肠黏膜样品（每份采集1～2 g），将肠黏膜样品冻存于-80℃，待测。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 血浆生化指标采用迈瑞BS-200 全自动生化分析仪和迈瑞生物公司生产的配套试剂盒检测蛋鸡血浆中ALP、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性和总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、葡萄糖（GLU）、尿素氮（UN）、钙（Ca）、磷（P）含量。

1.4.2 小肠黏膜刷状缘酶活性参照文献[10]将十二指肠和空肠黏膜样品用预冷的生理盐水按1:9（w:v=g:mL）在冰浴条件下用手持匀浆机（T10BS25，IKA 公司，德国）制备成10%的组织匀浆，将匀浆液于4℃下3 500 r/min离心10 min，小心吸取上清液。使用酶标仪（Multiskan GO，赛默飞世尔科技，美国）和南京建成生物工程研究所的试剂盒测定上清液中ALP、蔗糖酶、麦芽糖酶和乳糖酶活性。

1.4.3 小肠黏蛋白mRNA 表达水平使用Trizol 法提取十二指肠和空肠黏膜总RNA，在RNA 浓度和质量检测合格后进行反转录得到cDNA，然后进行实时荧光定量PCR，PCR 反应体系和反应程序参照文献[9]。引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列见表2，采用2−ΔΔCt法计算目的基因mRNA 表达水平。

表2 引物序列信息

1.5 统计分析利用SAS 9.2 软件中的一般线性模型程序对试验数据进行2×2 因子分析，分析主效应BS、SM及二者的互作效应。试验结果用平均值和集合标准误表示，P<0.05 表示差异显著，0.05 ≤P<0.10 表示有变化的趋势。

2 结果

2.1 BS、SM 及其联用对蛋鸡血浆生化指标的影响由表3 可知，主效应分析表明，添加SM 降低了血浆ALT 活性（P<0.05），添加BS 对各血浆生化指标均无显著影响，SM 和BS 的互作效应对GLU 含量有影响（P<0.05），对ALT、ALP 活性和ALB、Ca 含量有影响的趋势。

2.2 BS、SM 及其联用对蛋鸡小肠刷状缘酶活性的影响由表4 可知，主效应分析表明，添加BS 提高了蛋鸡空肠蔗糖酶活性（P<0.05），对十二指肠麦芽糖酶活性有影响的趋势；添加SM 提高了十二指肠乳糖酶活性（P<0.05），二者互作对所测定的小肠刷状缘酶活性均无显著影响（P>0.05）。

2.3 BS、SM 及其联用对蛋鸡小肠黏蛋白mRNA 表达水平的影响由表5 可知，主效应分析表明，添加BS 降低了蛋鸡空肠黏膜mcuin-2mRNA 表达水平（P<0.05），SM 上调了空肠mcuin-5acmRNA 的表达量（P<0.05），BS 和SM 对空肠mucin-2mRNA 表达水平有交互作用趋势。

3 讨论

3.1 BS、SM 及其联用对蛋鸡血浆生化指标的影响 ALT、AST 和ALP 是反映肝脏健康状况的主要指标。本试验发现，饲粮添加SM 显著降低了蛋鸡血浆ALT 活性，与前人的研究结果基本一致[11-12]，提示添加SM 可能利于维护蛋鸡肝脏健康。据报道，SM 能在动物肠道中吸附霉菌毒素、重金属、有害菌及其毒素等，有利于维持肠道屏障功能，可降低细菌和毒素易位，进而一定程度上减少肝脏损伤[10,13]。血液蛋白水平和UN 含量能够反映机体蛋白质的吸收利用情况，同时UN 也是评价肾功能的重要指标；TG、TC 和GLU 含量分别反映家禽体内脂质、糖类代谢水平，血Ca 和P 则反映机体对Ca、P 的利用情况。本试验发现，添加SM 对血浆中上述指标均无显著影响，提示其可能不影响蛋鸡机体养分代谢和肾脏功能，与Zhao 等[14]和王黎文等[15]的报道结果基本相符。

表3 BS、SM 及其联用对蛋鸡血浆生化指标的影响

表4 BS、SM 及其联用对蛋鸡小肠黏膜刷状缘酶活性的影响

表5 BS、SM 及其联用对蛋鸡小肠黏蛋白mRNA 表达水平的影响

本试验表明，BS 对所测定的血浆生化指标均无显著影响，提示BS 对蛋鸡机体养分代谢和肝肾功能可能不产生影响。类似的，BS 不影响蛋鸡血液中Ca、P、三酰基甘油和TC 含量[16]；而有研究指出，BS 显著降低了蛋鸡血液中TG、TC、UN 含量和AST、ALT 活性[17-18]。上述试验结果的差异可能跟蛋鸡健康状况、试验周期、养殖环境以及BS 来源、使用剂量等不同有关。本试验还发现，BS 和SM 对血浆GLU 含量存在互作效应，BS 和SM 联用组GLU 含量较其他组均有降低，提示二者联用可能一定程度上影响机体糖类代谢；动物应激时会使体内储存的糖原分解，并提高血浆GLU 浓度，这间接说明二者联用可能有利于增强蛋鸡抗应激能力。BS 和SM 互作对血浆ALP、ALT 活性有影响的趋势，二者联用组这2 种酶的活性均低于其他组，说明SM 与BS 联用后在一定程度上加强了对肝脏的保护作用，可能是由于二者联用增强了肠道屏障功能，有效降低了有害菌及毒素易位[19]，进而减少肝脏损伤。另外，二者互作对ALB和Ca 含量也有影响的趋势，提示二者联用后对机体蛋白质和Ca 代谢可能产生一定影响。

3.2 BS、SM 及其联用对蛋鸡小肠刷状缘酶活性的影响二糖酶活性的高低是评价肠上皮细胞发育程度和肠道功能的一项重要指标。研究表明，SM 可在一定程度上提高断奶仔猪空肠二糖酶的活性[6]。本试验中，SM 著提高了蛋鸡十二指肠乳糖酶活性，提示添加SM 可能有利于促进肠上皮细胞增殖，提高肠黏膜屏障功能。SM 提高小肠二糖酶活性的可能原因有两方面：一方面，SM具有阳离子交换性，其晶层中含有的铜、锌、Ca 等金属离子在畜禽肠道中被置换出来，之后被机体吸收或者在消化过程中发挥激活相关酶的作用；另一方面，SM作为一种消化道黏膜保护剂，可覆盖在肠道黏膜表面，有效减少霉菌毒素、有害菌及细菌毒素等造成肠上皮细胞的损伤，维持肠黏膜结构的完整性和正常功能的发挥，从而利于二糖酶的分泌[10]。此外，本试验发现，BS 显著提高了空肠蔗糖酶活性，与谢鹏等[3]的报道基本一致。完整的肠黏膜形态结构有益于二糖酶的分泌，BS 可能通过降低肠道有害菌数量，改善肠道形态，进而提高二糖酶活性[20]。肠道ALP 主要由肠上皮细胞分泌，若该酶活性降低，提示肠上皮细胞可能受损，肠绒毛萎缩，肠道功能下降[1]。本试验中，饲粮添加BS 和SM 对十二指肠、空肠黏膜ALP 活性均没有显著影响，说明BS 和SM 对蛋鸡肠上皮细胞的正常发育以及肠道功能不会产生负面影响。本研究中，BS 和SM 对小肠二糖酶、ALP 活性均没有产生互作效应，提示二者联用可能不影响蛋鸡小肠刷状缘酶的分泌。

3.3 BS、SM 及其联用对蛋鸡小肠黏蛋白mRNA 表达水平的影响黏蛋白是肠道免疫系统中第一道防线黏液层的主要成分，mucin-2和mucin-5ac是2 种重要的分泌型黏蛋白，对肠黏膜有直接保护作用[2]。本研究结果表明，SM 显著上调了空肠mucin-5acmRNA 的表达量，提示SM 可能有利于促进蛋鸡肠道黏蛋白的分泌。肠道杯状细胞数量是影响黏蛋白分泌的主要因素之一，研究指出，饲粮添加SM 有提高断奶仔猪小肠杯状细胞数量的趋势[7]。因此，推测SM 可能是通过影响肠道杯状细胞的分泌来提高肠道黏蛋白的表达水平；也可能与其具有修复和保护肠道黏膜的作用有关。另外，本试验结果显示，BS对十二指肠mucin-2和mucin-5acmRNA 表达量没有显著影响，但对空肠这2 种黏蛋白的表达有负面作用。而Aliakbarpour 等[4]发现，BS 能显著提高肉鸡空肠mucin-2mRNA 表达量；也有研究指出，益生菌可能与肠上皮细胞中的特定受体位点结合并刺激黏蛋白的分泌[21]。鉴于前人发现益生菌对动物肠道黏蛋白的表达具有促进作用，本试验的结果还需进一步验证。