利用鸡胚表达谱数据筛选皮肤发育相关基因的研究

樊庆灿

（宜春学院生命科学与资源环境学院，江西宜春 336000）

动物皮肤在体温调节、保护、感觉、伪装和交配中发挥重要作用，这些功能是通过皮肤及其衍生物特有的生理结构完成的。动物发育过程中外胚层表皮与中胚层真皮相互作用，分化成多种多样的皮肤和衍生物[1]。在皮肤发育的研究中，鸡是一种理想模型，这是由于鸡躯体被覆羽毛，胫部含有鳞片状皮肤表面，代表了比较典型的皮肤结构，对其发育调节的研究有助于促进对人类皮肤发育机理的研究。在禽类皮肤研究中，发现多个基因参与皮肤发育过程，如成纤维细胞生长因子10（Fibroblast Growth Factor 10，FGF10）的表达促进羽芽发育[2]，骨形态发生蛋白2（Bone Morphogenetic Protein 2，BMP2）和骨形态发生蛋白4（Bone Morphogenetic Protein 4，BMP4）可以通过抑制羽芽发育调节羽径大小[3]，德尔塔1 基因（Delta1，DELTA1）诱导鳞片皮肤发育[4]，BMP 受体蛋白等则将鳞片转化为羽毛[5]，Wnt 信号通路参与了整个皮肤形态发生过程[6]等。鸡发育初期的皮肤上皮（7 d 羽毛皮肤和9 d 鳞片皮肤）具有高度可塑性，蕴含分化为羽毛或鳞片的潜能[7]，决定早期胚胎羽毛和鳞片皮肤的命运。本研究利用鸡胚表达谱数据[8]，结合生物信息技术，筛选影响鸡胚胎羽毛和鳞片皮肤发育的调控通路和相关基因。本研究成果将有利于人类皮肤发育机理的研究。

1 材料方法

1.1 数据采集 本研究表达谱数据来自基因表达数据库，编号为GSE62882（https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi），样品信息见表1，包括白来航鸡7日龄胚胎背侧皮肤上皮样品（FE7）2 个、背侧皮肤间充质（FM7）样品2 个，9 日龄胚胎背部皮肤上皮（FE9）样品3 个、背部皮肤间充质（FE9）3 个，9 日龄胚胎跖皮肤上皮样品（SE9）2 个、跖皮肤间充质（SM9）2个，11 日龄胚胎跖皮肤上皮（SE11）3 个、跖皮肤间充质（SM11）3 个，共20 样品，采用Affymetrix Chicken Genome Array（GPL3213）进行表达谱测序，获得20个样品33 457 个转录本的数据[8]。

1.2 统计软件 表达谱数据的转换、表达差异分析使用在线软件GEO2R（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）。显著基因的互作分析使用在线软件STRING（https://string-db.org/cgi/input.pl? sessionId=NPdugdy y2MoP & InInput_page_show_ search=on），基因互作分析图、核心基因计算作图和GO 分析作图均使用软件Cytoscape 3.6.1。基因通路分析（KEGG）使用在线软 件DAVID（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp），韦恩图解分析使用在线软件Veen Diagram（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)。

表1 20 个样本的信息统计表

1.3 分析方法 GEO2R 中输入编号GSE62882，获取20个样本信息，进行log 转化后绘制箱式图观察表达谱数据分布，并按照表1 将样本定义为8 个组，按照FE7-FE9、FM7-FM9、SE9-SE11 和SM9-SM11 两两进行表达差异分析，并分别命名为FE7-9、FM7-9、SE9-11 和SM9-11，选择False discovery rate（FDR）法进行P值调整（Padj），基因注释选择NCBI。

4 组差异基因（P<0.01）分别输入到Venn diagram中进行韦恩图解分析，获得差异分析的共同基因。使用String 对4 组显著基因（P<0.01）进行基因互作分析，根据参与互作网络的基因数目的差异，确定最低综合得分值，导出4 组分析差异基因的互作网络数据，并导入Cytoskype 中作图，删除位于互作图边缘地带的基因。核心基因的计算使用cytoHubb 插件的Betweenness 算法，并对核心基因进行合并分析。差异基因（P<0.01）的GO 分析采用Cytoskype 软件中的BINGO 插件，KEGG 分析使用在线软件DAVID。

2 结果

2.1 数据标准化和箱式图 如图1 所示，样本的下、上边缘值分别为（2.43±0.03）和（13.39±0.33），下、上四分之一值分别为（4.15±0.07）和（7.85±0.09），中位数为（5.65±0.02），说明20 个样本表达量数据比较一致，可以进行转录本的差异分析。

图1 20 个样本表达量数据标准化后的统计信息

2.2 基因表达差异分析 由表2 可知，FE7-9 筛选出28个Padj<0.05 和590 个P<0.01 的基因，9 日龄与7 日龄相比，191 个基因（P<0.01）上调，399 个基因（P<0.01）下调，上调基因细胞基质蛋白（Periostin,POSTN）是Padj最小且差异倍数最大的基因。FM7-9 筛选出1 个Padj<0.05和473 个P<0.01 的基因，其中185 个基因（P<0.01）上调，288 个基因（P<0.01）下调，上调基因海绵糖基因（Spondin 2,SPON2）的差异倍数最大。SE9-11 筛选出116 个Padj<0.05 和795 个P<0.01 的基因，11 日龄与9 日龄相比，上调基因（P<0.01）292 个，下调基因（P<0.01）503 个，其中下调基因丝氨酸/苏氨酸激酶基因（Serine/Threonine Kinase 32B,STK32B）的Padj最小且差异倍数最大。SM9-11 筛选出0 个Padj<0.05 和73个P<0.01 的基因，45 个基因（P<0.01）上调（P<0.01），28 个基因（P<0.01）下调，其中上调基因角蛋白5 基因（Keratin 5，KRT5）的差异倍数最大。

4 组差异基因（P<0.01）韦恩图解分析结果如图2 所示，脂肪酸结合蛋白（Fatty Acid Binding Protein7，FABP7）在4 组差异分析中均为差异基因（P<0.01），FE7-9、FM7-9 和SE9-11 有27 个共同基因。FE7-9 和SE9-11含有184 个共同基因（FE-SE）。对FE7-9、FM7-9、SE9-11、SM9-11 和FE-SE 的基因进行核心基因分析并合并作图（图3），可见核心基因组成一个较大的互作网络，并通过关键基因纤维连接蛋白1（Fibronectin1，FN1）和血小板源性生长因子（Platelet Derived Growth Factor Subunit B，PDFGB）连接在一起。

表2 差异表达分析筛选的显著基因信息

图2 4 组差异表达基因的韦恩图解分析

图3 4 组差异分析的核心基因合并后的互作图

2.3 差异基因的GO 分析 如图4 所示，FE7-9、FM7-9、SE9-11 和SM9-11 分别富集到21、8、20 个和0 个显著的条目（P<0.01），FE7-9、FM7-9 和SE9-11 筛选到3 个显著基因最多的共同GO 条目，从上到下分别为多细胞组织过程（0032501）、发育过程（0032502）和单细胞组织发育（0007275），这3 个条目在FM7-9 和SE9-11 的GO 分析中P值最小。关键核心基因PDFGB和基因POSTN存在于上述所有GO 条目中。FE7-9 中P值最小的GO 条目为生物黏附（0022610）和细胞黏附（0007155），关键的核心基因FN1和基因POSTN属于该条目。

2.4 差异基因的信号通路分析 如图5 所示，4 组差异基因分别筛选出5、7、10、2 条调节通路。FE7-9、FM7-9、SE9-11 中筛选的P值最小的信号通路分别为氮代谢（00910）、MAPK 信号通路（04010）和Wnt 信号通路（04310）。黏附斑激酶信号通路（04510）是SM9-11 通路分析中发现的P值最小的通路，也是4 组差异分析中筛选到的共同通路，FE7-9、FM7-9、SE9-11 和SM9-11 的差异基因中分别有12、10、17、4 个基因参与了此通路，FN1和PDGFB等5 个核心基因参与了此通路。

3 讨 论

3.1 差异表达基因分析 本研究筛选了鸡胚胎皮肤上皮和间充质组织的差异表达基因，羽毛和鳞片上皮组织中共筛选到144 个差异基因（Padj<0.05），间充质组织中只筛选到1 个差异表达基因（Padj<0.05），说明胚胎发育初期（7～11 d）的皮肤上皮比间充质更为活跃。9 胚龄与7 胚龄相比，背部羽毛上皮下调的基因数远远高于上调的基因数，11 胚龄与9 胚龄相比，鳞片上皮下调的基因数远远高于上调的基因数，可能是羽毛皮肤（9 d）、鳞片皮肤（11 d）已经历了细胞的发育高峰，胚胎发育初期的羽毛皮肤（7 d）和鳞片皮肤（9 d）是皮肤发育的关键时期[9]。韦恩图解分析中，FE7-9 与SE7-9 有较多的共同基因，羽毛皮肤和鳞片皮肤的发育过程具有很多的相似性。

3.2 差异基因的GO 分析 4 组差异表达基因的GO 分析中，筛选出3 条相同的GO 条目，下级条目单细胞组织发育指多细胞有机体从最初的状态（如合子）发展到后来状态的生物过程，包括胚胎分化和生长的整个过程。本研究差异基因的GO 分析富集在单细胞发育及相关条目基因数最多，因为皮肤发育是胚胎发育的一部分，出现这种结果也是必然的。FE7-9 富集在细胞黏附基因数均28 个。7～9 日龄胚胎是皮肤分化发育关键时期，本研究筛选到28 个黏附相关基因。在胚胎发育过程中，细胞与细胞、细胞和基质之间的黏附和定向细胞移动，是细胞分化和发育成特定组织器官的基础，在整个过程中，黏附分子发挥着重要作用[9]，其广泛参与了鸡胚胎皮肤细胞的分化发育。这与本研究的结果一致。

图4 差异表达基因GO 树状分析图

图5 差异表达基因KEGG 分析的显著通路

3.3 FAK 信号通路和关键基因 KEGG 分析中筛选出的共同信号通路是FAK 信号通路。FAK 通路参与调节细胞生长、凋亡、黏附和迁移等各细胞过程[10]，并通过调节金属蛋白酶-9（Matrix Metallo Proteinase 9，MMP-9）活性导致细胞外基质的降解，调控细胞粘附性[11-13]。研究发现，细胞黏附在禽类羽毛图案的形成中起着中心作用[14]，细胞黏附活动不仅促进细胞聚集形成真皮[15]，稳定的细胞聚集体还能启动表皮板的形成[16]。本研究筛选出的基因中，PDFGB、FN1和POSTN都是FAK 信号通路相关的基因。PDFGB能刺激细胞合成大量特定的细胞外基质，引起细胞增殖、迁移和分化[17-18]，其异常表达导致皮肤纤维瘤的发生[19-20]。FN1通过结构域与细胞表面受体、纤维蛋白等特异性结合，调控细胞的迁移、分化和黏附[21]，参与胚胎细胞分化和器官形成[22]。POSTN参与细胞的募集和黏附，调节胚胎发育[23]，并通过结合整合素类蛋白来激活FAK 信号途径发挥调节作用[24]。

目前禽类皮肤发育的研究较少，相关基因及调节机理并不完全清楚。本研究发现的黏附斑信号通路具有广泛的生物功能，但其对禽类皮肤发育的调节作用未见报道。3 个关键基因PDFGB、FN1和POSTN与FAK 信号通路有关，并在细胞黏附和胚胎发育中具有重要的调节作用。正如前人所言，细胞黏附活动是细胞分化和发育成特定组织器官的基础[9]，FAK 信号通路介导的细胞黏附活动是禽类胚胎皮肤发育研究的重要方向。

4 结 论

本研究利用数据库数据和生物信息技术，筛选影响鸡胚胎皮肤发育的差异表达基因，发现胚胎发育早期（7 d羽毛皮肤和9 d 鳞片上皮）是皮肤发育的关键时期。筛选的基因中与单细胞组织发育相关的基因最多，羽毛上皮（7 d、9 d）部分差异基因富集在细胞黏附。FAK 信号通路介导的细胞黏附活动可能参与鸡胚胎皮肤的整个发育过程，关键基因PDGFB、FN1和POSTN是值得关注的候选基因。