长白山野杂猪和东北民猪背最长肌的mRNA转录组比较分析

2020-09-18金太花娄安钢季久秀李钟淑关立增

中国畜牧杂志 2020年9期

金太花，娄安钢，季久秀，李钟淑，关立增*

（1.临沂大学农林科学学院，山东临沂 276005；2.延边大学农学院，吉林延吉 133002）

长白山野猪作为我国特有的猪种资源，具有瘦肉率高、不饱和脂肪酸含量高和抗病力强等特性，但野猪肉具有肉质坚硬、土腥味大等缺点[1-2]。东北民猪虽然具有生长速度快的优势，但其瘦肉率和不饱和脂肪酸含量低等肉质缺点已不能满足消费者日益增长的需求[3]。因此，利用长白山野猪与东北民猪杂交制备长白山野杂猪正成为改良家猪生产性能与肉品质的主要方法之一。长白山野杂猪具有肉质柔软鲜嫩、纤维较细、肉色好、脂肪入口即化等特点，也克服了野猪肉质坚硬、土腥味大的特性与家猪肉中亚油酸含量低等弊端[4]。本课题组前期研究发现，长白山野杂猪肉中的不饱和脂肪酸（C14:1、C16:1、C18:1T、C18:1C、C20:1N9）含量显著高于东北民猪[4]。但关于长白山野杂猪与东北民猪肉质性状差异形成的分子机理还不清楚，有待进一步研究。随着现代生物技术的快速发展，与肉质性状相关的基因陆续被发现，这对动物肉质性状的研究起到了巨大推动作用，其中在转录组水平上对影响肉质性状基因的研究，可揭示影响肉质性状的分子机理[5-7]。目前关于猪肉质相关转录组的研究已有一定进展。如Wu 等[8]在分析金华猪和长白猪背最长肌的全基因表达谱时发现，金华猪中与脂肪酸生物合成调节有关的基因表达水平高于长白猪。Yu 等[9]对蓝塘猪和长白猪背最长肌中与脂肪酸组成有关的候选基因进行研究发现，在2 个猪种之间差异表达的基因有586 个，其中在蓝塘猪中高表达的基因有267个，13 个基因被确定为肌肉脂肪酸组成的候选基因。Corominas 等[10]分析了长白猪×伊比利亚猪杂交猪与长白猪回交猪的背部肌内脂肪酸的组成，结果显示，在2 个猪种之间共筛选到的候选基因有396 个，其中在高肌内饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸群体中有247 个基因表达较高，而在高多不饱和脂肪酸群体中有149 个基因表达较高。Anna 等[11]对伊比利亚猪与长白猪回交所得到猪中有极端表型群体的背最长肌的转录组进行分析发现，与肌内脂肪沉积有关的差异基因有18 个。而目前关于长白山野杂猪与东北民猪背最长肌基因的mRNA转录组分析还未见报道，有待进一步研究。本研究将通过RNA-Seq 技术对长白山野杂猪与东北民猪背最长肌基因的mRNA 转录组差异进行分析，为揭示长白山野杂猪与东北民猪的肉质性状差异机理提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 3 头F1代长白山野杂猪和3 头东北民猪，其中F1代杂交猪是由长白山野猪和东北民猪杂交得到（野猪♂× 东北民猪♀），3 头长白山野杂猪均为同父；3 头东北民猪为同母。所有实验猪均饲养于延边金村长野生动物养殖专业农场。生长前期圈养，每日饲喂3 次，生长后期放养，每日饲喂2 次，自由采食，自由饮水。实验期间按照特种野猪场正常的免疫程序进行免疫，分别饲喂至120 kg 左右进行屠宰。

1.1.2 采样宰前将长白山野杂猪和东北民猪赶入待宰圈，禁食不禁水24 h。电麻后倒挂放血、褪毛，屠宰后，取左半胴体背最长肌并分割成0.5 cm3左右小组织块装入冻存管，立即放于液氮中，用于RNA-seq 分析。

1.1.3 试剂反转录试剂购自大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）；RNA Extraction Kits 试剂盒、RNA-seq 试剂盒购自美国Illumina 公司。

1.2 背最长肌总RNA 的提取背最长肌组织中的RNA提取主要按ExRNA Extraction Kits 试剂盒步骤进行。

1.3 mRNA 的高通量测序

1.3.1 cDNA 文库的构建根据RNA 反转录试剂盒进行总RNA 的反转录，通过两步法进行cDNA 双链的合成并进行纯化，将纯化的cDNA 进行末端修复后依次进行末端dA 加尾和接头连接反应，然后进行连接产物的纯化，将纯化的连接产物进行PCR 扩增，获得cDNA 文库，最后将获得的cDNA 文库通过LC 公司的Illumina 测序平台完成mRNA 高通量测序。

1.3.2 cDNA 文库的RNA-seq 测序与质量控制通过Illumina 公司的High-seq 测序平台分别对获得的上述样品进行双末端测序。测序流程为：总RNA →利用Oligo(dT)富集mRNA 和去除rRNA 富集mRNA →mRNA 打断成200 nt →随机引物六聚体合成cDNA →末端修复、加dA 和加接头后PCR 扩增→Illumina 测序。将测序得到的原始序列（raw reads）中带有接头的、含有poly-N 和低质量的序列去掉，以便获得干净序列（clean reads）。最后用Q20 与Q30 方法分析碱基测序错误率，以此来分析测序质量的高低。

1.3.3 测序序列比对分析与表达水平确定利用TopHat和Bowtie 软件参照猪基因组序列对长白山野杂猪和东北民猪背最长肌组织转录组数据进行比对与注释。采用 HTSeq0.5.3 软件计算比对到基因组上转录本的序列（reads）数，确定基因的转录水平。

1.3.4 差异表达转录本的鉴定本研究利用DEGSeq R package v1.10.1 系统对长白山野杂猪与东北民猪之间的差异表达基因进行分析。利用Cufflinks vl.3.0 程序包对来自于TopHat 的数据的己知转录本及新转录本进行分析。

1.3.5 GO 和KEGG 富集分析利用GOseq R 软件包对差异基因进行GO 富集分析。利用KOBAS 软件对差异基因进行信号通路富集分析。

1.4 数据分析结果以平均值±标准差表示；采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）方法对长白山野杂猪和东北民猪之间的差异表达 mRNA 进行分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 原始序列数据的质量控制分析显示，长白山野杂猪与东北民猪的Q20 值都达到96% 以上，Q30 值都达到91% 以上。随后对测序错误率分布和GC 含量分布进行了检测，结果显示，测序过程中碱基错误率均低于0.5%，说明测序质量较高。通过过滤得到的干净序列在长白山野杂猪与东北民猪2 个文库数据量均大于20 G，说明获得的干净序列可用于随后的转录组分析。

2.2 测序序列比对将过滤后得到的干净序列采用Tophat 软件进行序列比对分析，结果显示，在长白山野杂猪与东北民猪中均有100% 以上的序列能完全比对到猪基因组上，而所转录的基因占总基因的比例在3 头长白山野杂猪中平均为59.67%（分别是58.88%、59.37%、60.75%），在3 头东北民猪为58.73%（分别是57.88%、58.80%、59.51%），而在不同个体间SNP位点数达到14 299～19 671。

2.3 转录本表达水平分析分析显示，在长白山野杂猪与东北民猪2 个品种中共有17 171 个基因表达，东北民猪中有16 552 个基因表达，长白山野杂猪中有16 461 个基因表达。其中有15 842 个基因在长白山野杂猪与东北民猪中进行了共表达（图1）。其中在东北民猪中特异表达的基因有710 个，在长白山野杂猪中特异表达的基因有619 个。对长白山野杂猪与东北民猪中的基因数目进行分析发现，在2 个品种猪中约有15% 的基因为高丰度表达；约有25% 的基因为中丰度表达；约55%的基因为低丰度表达。

2.4 差异表达基因分析分析显示，在长白山野杂猪与东北民猪背最长肌中一共检测到153个显著差异表达基因，其中在长白山野杂猪与东北民猪中显著高丰度差异表达的前10 个基因中，PDLIM3（ENSSSCG00000015796）基因在长白山野杂猪和东北民猪中的丰度均为最高（图1、图2）。相对于东北民猪，在长白山野杂猪中有55个为上调表达基因，98 个为下调表达基因。表1 分别列出了前10 个显著差异表达的上调及下调基因，其中一些基因与肉品质有密切关系，如SCD 基因与机体内不饱和脂肪酸生成有关。

图1 长白山野杂猪与东北民猪2 个猪种中差异表达基因散点图

图2 在长白山野杂猪与东北民猪中高丰度表达的前10 个差异表达基因

2.5 差异表达基因的GO 分析分析发现，在长白山野杂猪与东北民猪背最长肌中，153 个差异表达基因被注释到了33 条GO 条目中。其中注释到生物学过程中的有11 条，注释到细胞组分的有11 条，注释到分子功能中的有11 条（图3）。

2.6 差异基因的KEGG 分析分析显示，153 个差异表达基因与130 条通路有关，每条通路中含有从1 到10 不等的差异基因，本文列出了富集程度排名前20 的pathway 条目（图4）。

3 讨论

相对于传统芯片技术而言，RNA-seq 测序可快速获得某一组织细胞几乎所有的转录本，不需要探针的预先设计，因此对任何物种及任何细胞来源的转录组都可进行检测[12-14]，具有更精确的数字化信号、检测通量高以及检测范围更广等优点[15-17]。该技术还可对未知转录本及稀有转录本进行测序分析，因而是目前深入研究转录组复杂性的强有力的工具[18-19]。本研究采用RNA-seq测序技术对长白山野杂猪与东北民猪的背最长肌的转录组进行了研究，结果显示，一些显著生物通路和生物过程中（如脂肪代谢）的差异基因在长白山野杂猪和东北民猪中表达差异较大，初步证明了这些差异基因可能与长白山野杂猪和东北民猪背最长肌肉质性状的差异有关。

本研究的实验对象为长白山野杂猪和东北民猪，虽然各品种猪外界生长环境一致，但为避免个体间差异对实验结果造成影响，本研究对每个品种猪的3 头猪样本的文库进行了分别构建并进行单独测序，以保证数据的独特性，该方法相对于混合样测定方法来说准确性更高[20]。本研究对长白山野杂猪与东北民猪的转录组系统分析结果显示，2 个猪种之间基因表达数量存在差异，特别是不同个体间SNP 位点数达到14 299～19 671，说明在不同个体及猪种之间基因的碱基组成上存在差异。该结果进一步证明样本的单独测序分析法可靠性更高。

差异表达基因分析结果显示，2 个品种猪存在着差异表达基因，如PDLIM3基因在长白山野杂猪和东北民猪中的丰度均为最高，但该基因是否与肉质性状差异存在密切关系还需要进一步研究。前人研究表明，肌肉中的脂肪酸含量与肉质性状密切相关[8-9,21]。而本研究发现的差异表达基因SCD与机体内不饱和脂肪酸生成有密切关系，但长白山野杂猪和东北民猪的肉质性状差异是否与SCD基因调控不饱和脂肪酸含量有关还需要进一步研究。

本研究对长白山野杂猪与东北民猪背最长肌之间的差异表达基因进行了GO 功能分类和KEGG 通路富集分析，GO 分析结果显示所有差异表达基因参与的生物学过程主要涉及有氧和活性氧代谢过程、模式分化过程和过氧化物代谢过程等；涉及的细胞组分主要有细胞顶部、MHCII 蛋白复合物等；涉及分子功能的主要有脂质结合、维生素结合等。但这些成分中哪些与肉质性状相关还需要进一步分析。而KEGG 分析结果显示，153 个差异基因参与了130 个KEGG 基因信号通路，其中一些与脂肪代谢和骨骼肌发育相关的信号通路有关。其中在差异表达基因显著富集的通路中，发现了一些与调节脂类代谢显著相关的PPAR 信号通路和Fatty acid metabolism 途径，根据该结果推断在长白山野杂猪与东北民猪的背最长肌中脂类代谢的差异可能是由于PPAR信号通路和Fatty acid metabolism 通路中的一些相关基因表达水平的差异引起的，这与杨建敏的研究结果相似，即PPAR 信号通路是引起槐猪杜洛克猪脂类代谢的主要通路[22]。上述分析结果为进一步筛选长白山野杂猪与东北民猪肉质性状差异的主效功能基因提供参考。