骨肉瘤组织中IMP3表达及MVD与患者临床病理特征的关系

周伟，陈敬有，魏优秀，李贺伟

华中科技大学同济医学院附属梨园医院，武汉 430000

骨肉瘤是一种发病率较高的原发性恶性肿瘤，好发于青少年，恶性程度高，起病早期即可发生血行转移，致残率与致死率均处于较高水平[1]。骨肉瘤的发生、转移、复发具有多阶段的特性，是多因素相互作用的结果，其具体机制目前尚未完全明确[2]。胰岛素样生长因子Ⅱ mRNA结合蛋白3(IMP3)是一种新发现的癌症相关蛋白，生理情况下表达于胚胎组织中，罕见于成年机体的正常组织，但当成年机体的细胞发生癌变时，会由于去分化现象而重新分泌胚胎时期特有的蛋白，因此IMP3被发现表达于多种肿瘤组织中[3]。微血管密度(MVD)可以定量地反映血管生长情况，因此通常被认为是血管生成强度最重要的指标之一[4]。目前临床上对于MVD值的检测以CD34、CD31等血管内皮细胞标记物的表达为主要手段[5]，本研究选择在血管中表达较为广泛的CD34为标记物。本研究采用SP免疫组化法检测骨肉瘤组织中IMP3、MVD的表达，探讨IMP3、MVD在骨肉瘤的发生与恶性进展过程中的作用，并预测其成为骨肉瘤相关肿瘤标记物的可能性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年1月～2019年12月本院收治的骨肉瘤患者70例，其中男42例、女28例，年龄9～39岁；<18岁29例，≥18岁41例；肿瘤直径<5 cm者29例，≥5 cm者41例；病变部位：股骨20例，胫骨19例，肱骨12例，其他19例；Enneking分期Ⅰ期17例，Ⅱ期27例，Ⅲ期26例；39例未发现肺转移，31例出现肺转移。纳入标准：经病理确诊为原发性骨肉瘤；患者临床病历资料完整，存档蜡块组织保存完好；术前未经其他抗肿瘤治疗；未合并其他影响免疫组化结果的疾病。

1.2 骨肉瘤组织中IMP3表达、MVD检测

1.2.1 免疫组化染色 本研究中，IMP3检测所用一抗为兔抗人IMP3多克隆抗体；MVD检测以CD34标记，一抗为兔抗CD34多克隆抗体；试剂均购自美国Santa公司。SP通用免疫试剂盒购自深圳子科生物科技有限公司。以PBS作为阴性对照一抗。将存档蜡块标本以4 μm为间隔，连续切片，常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化。于95 ℃修复抗原15 min，加入3%双氧水以消除内源性过氧化物酶活性。加入一抗，于4 ℃孵育过夜。加入羊抗兔IgG工作液，37 ℃孵育30 min。滴加链霉亲和素工作液，37 ℃孵育30 min。DAB显色，苏木素复染。常规脱水，制片，封片。

1.2.2 结果判定 本研究染色结果判定均由两位病理科高年资医师独立判定。若两位医师意见相左，则报请病理科主任判定，若仍不能确定结果则排除该病例。

IMP3阳性染色定位于细胞质，采用半定量法判定，于高倍(×400)光学显微镜下，取6个阳性细胞较多的视野，每个视野细胞数不少于100个，最终结果取各视野结果的算术平均数。将染色结果分为程度计分(无着色计0分，淡黄色至黄色计1分，棕黄色计2分，褐色计3分)与数目计分(染色细胞<5%计0分，5～30%计1分，>30～60%计2分，>60%计3分)。将两项计分相乘作为染色总结果，≤1为阴性、>1为阳性。

MVD染色先于低倍(×40)光学显微镜下浏览切片，找寻血管密集、染色对比度较高的区域，再于高倍(×400)光学显微镜下计算血管数目。依照Weidner法[6]，将棕色染色的单个血管内皮细胞或内皮细胞束视为一个微血管数，但厚平滑肌层或管腔切面面积>8个红细胞直径的血管不计入。取6个不同视野，MVD值为6个视野的算数平均数。

2 结果

2.1 骨肉瘤和癌旁组织中IMP3表达、MVD比较 IMP3在骨肉瘤组织中阴性7例、阳性63例，癌旁组织中阴性43例、阳性27例，骨肉瘤组织中IMP3的表达高于癌旁组织(P<0.05)。骨肉瘤和癌旁组织MVD值分别为55.97±9.64、48.02±3.93，骨肉瘤组织MVD值高于癌旁组织(P<0.05)。

2.2 骨肉瘤组织中IMP3表达和MVD与患者临床病理参数的关系 骨肉瘤组织中，IMP3的表达与性别、年龄、病变部位无关(P均>0.05)，而与肿瘤直径、Enneking分期、肺转移有关(P均<0.05)；MVD值与性别、年龄、病变部位无关(P均>0.05)，而与肿瘤直径、Enneking分期、肺转移有关(P均<0.05)。见表1。

2.3 骨肉瘤组织中IMP3表达和MVD的关系 IMP3在骨肉瘤组织中阴性7例、阳性63例，MVD值分别为45.11±7.62、57.19±9.09，骨肉瘤组织中IMP3和MVD的表达呈正相关(r=0.493，P=0.001)。

3 讨论

随着现代医学的发展，骨肉瘤的治疗方法由单纯的外科治疗，转变为保肢治疗为主结合新辅助化疗、外科治疗、放疗等手段的综合诊疗方案[7,8]，患者的5年生存率因此从不足20%上升至60%～70%[9,10]，保肢率可达90%以上[11]。但近来患者的5年生存率改善遇到瓶颈，骨肉瘤对患者及其家属造成的精神及经济压力并没有得到满意的改善。寻找特异性高的骨肉瘤标记物，建立敏感的早期诊断检测方案，进一步深入研究骨肉瘤的发生、恶性进展的机制，以寻求治疗方法的突破是临床上迫切的需求。

表1 骨肉瘤组织中IMP3表达、MVD与患者临床病理参数的关系

IMP3最初被称为“癌症中过表达的K同源区控制蛋白”[3]，定位于染色体7p11.5，长度约64 kD。IMP3能与胰岛素样生长因子(IGF)Ⅱ mRNA的5′非翻译区结合，从而调节IGF Ⅱ mRNA的定位、翻译及反转录作用[12,13]。IMP3在许多恶性肿瘤组织中均有表达，是近来研究的热点之一。Yan等[14]发现，IMP3在非肿瘤肺组织中未见阳性表达，但在肺腺癌组织中阳性表达率上升至41.1%，且IMP3阳性表达的肺腺癌组织的恶性程度较高；El-Balat等[15]发现，IMP3仅在原发性卵巢交界性肿瘤中呈阳性表达，而在其他病理类型的卵巢组织中未见表达；Elshafey等[16]则证实，IMP3在涎腺黏液表皮样癌中异常高表达，且与多种临床病理参数密切相关，但在其他类型的表皮样癌中未见表达，是一种极具潜力的早期诊断、预后评估指标。本研究结果中，IMP3在骨肉瘤组织中的阳性表达率较癌旁组织高，由此可以推断IMP3与骨肉瘤的发生相关。进一步研究发现，骨肉瘤组织中IMP3的表达与肿瘤直径、Enneking分期、肺转移等反映肿瘤恶性程度的临床病理参数有关，因此可以将IMP3视作与骨肉瘤的恶性程度相关，与前述IMP3在其他恶性肿瘤中的表现类似。

MVD值用免疫组化法标记肿瘤组织内微血管，后依据不同标准所计算出的单位面积中微血管的数目。MVD值能够较为直观地表现肿瘤组织的血管形成能力，被认为是目前能够反映肿瘤组织中血管生存活性的重要指标[17]。而微血管的生成是肿瘤侵袭、转移的重要步骤之一，与肿瘤的恶性程度密切相关。Yang等[18]通过对肝细胞癌的临床研究发现，CD34标记的MVD值与肿瘤的大小、淋巴结转移等参数有关，且是肝细胞癌患者预后的独立影响因素；田墨涵等[19]则发现CD34标记的MVD值在结直肠癌组织中升高，且与结直肠癌的TNM分期、血行转移相关。本研究同样选择检测CD34标记的MVD值，SP免疫组化染色结果显示，骨肉瘤组织的MVD值高于癌旁组织，因此骨肉瘤组织中微血管的生存能力高于癌旁组织。进一步研究发现，骨肉瘤组织中MVD值与肿瘤直径、Enneking分期等反映肿瘤恶性程度的临床病理参数有关，且发生肺转移的骨肉瘤患者MVD值较未转移者高，差异具有统计学意义。可见MVD值能在一定程度上反映骨肉瘤的恶性程度。

张亚军等[20]发现，子宫颈鳞状细胞癌组织中IMP3与CD34标记的MVD值均上升，且与肿瘤的恶性程度有关，IMP3的表达与MVD值呈正相关。本研究结果显示，骨肉瘤组织中IMP3的表达与MVD值同样呈正相关。骨肉瘤中IMP3与MVD的作用可能与其在子宫颈鳞状细胞癌中的作用相类似，同样参与恶性肿瘤的发生，并在肿瘤的浸润、转移等恶性进展中起促进作用。

综上所述，骨肉瘤组织中IMP3表达、MVD异常上调，且与肿瘤的恶性程度密切相关。骨肉瘤组织中IMP3、MVD可能参与骨肉瘤的发生、发展。联合检测IMP3、MVD的表达有可能成为骨肉瘤早期鉴别诊断、治疗方案制定相关的生物标记物。